乳腺癌組織中沉默信息調節因子和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的表達及臨床意義

高琳璐 于國華 張居民

1.濰坊醫學院研究生學院，山東濰坊261000；2.山東省濰坊市人民醫院，山東濰坊261000

乳腺癌組織中沉默信息調節因子和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的表達及臨床意義

高琳璐1于國華2張居民2

1.濰坊醫學院研究生學院，山東濰坊261000；2.山東省濰坊市人民醫院，山東濰坊261000

目的探討沉默信息調節因子（SIRT1）和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC）在乳腺癌組織中的表達及其與臨床病理指標之間的關系。方法收集濰坊市人民醫院2014年1～6月經病理明確診斷的乳腺浸潤性導管癌石蠟標本60例和乳腺纖維瘤標本15例，應用免疫組化法檢測乳腺癌組織和乳腺纖維腺瘤組織中SIRT1和SPARC的表達情況。結果SIRT1在乳腺癌組織中的陽性表達率（61.7%，37/60）明顯高于乳腺纖維腺瘤組織（33.3%，5/15），差異有統計學意義（P＜0.05）；有乳腺癌淋巴結轉移的SIRT1高表達率（72.0%，18/25）高于無淋巴結轉移（25.7%，9/35），TNM分期為Ⅲ期的乳腺癌中SIRT1高表達率（77.3%，17/22）高于Ⅰ、Ⅱ期（26.3%，10/38），差異均有高度統計學意義（P＜0.01）。SPARC在乳腺癌間質細胞的高表達率（73.3%，44/60）明顯高于腫瘤細胞（10.0%，6/60）和乳腺纖維腺瘤間質細胞（40.0%，6/15），差異均有統計學意義（P＜0.05）；SPARC在乳腺癌有淋巴結轉移的高表達率（96.0%，24/25）高于無淋巴結轉移的（74.3%，26/35），差異有統計學意義（P＜0.05）。結論乳腺癌中SIRT1、SPARC的高表達與乳腺癌的發生、發展、侵襲和轉移有關。

乳腺癌；乳腺腫瘤；SIRT1；SPARC

據世界衛生組織（WHO）統計資料顯示，2000年全球新發女性乳腺癌病例超過100萬，標化發病率為35.66/10萬，標化病死率為12.5/10萬，乳腺癌已成為全球婦女首發惡性腫瘤。在乳腺癌的病理類型中，浸潤性導管癌惡性程度較高，預后較差。沉默信息調節因子（SIRT1）基因位于10q22.1，長約33 kb，蛋白分子量約為60 kU，具有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴的脫乙酰基酶活性，其廣泛存在于人體各個細胞內。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（SPARC），是一種非膠原糖蛋白，它在腫瘤中的作用是促進腫瘤細胞黏附，誘導腫瘤細胞遷移，并改變腫瘤細胞基質成分。兩者均與乳腺癌的發生、發展、浸潤和轉移有關。本研究采用免疫組化檢測SIRT1和SPARC在乳腺癌組織中的表達情況，并進一步分析SIRT1、SPARC與臨床病理因素之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

標本均為來源于濰坊市人民醫院2014年1～6月經病理明確診斷的乳腺浸潤性導管癌石蠟60例和乳腺纖維瘤15例，均為女性，年齡≥18歲，中位年齡43歲。所有乳腺癌患者均接受乳腺癌改良根治術或保乳術，術前均未行任何放療及化療治療，無嚴重、未控制的內科疾病及感染，無病生存時間≥6個月。本研究已經醫院倫理委員會研究通過，本研究均在患者及家屬知情同意并簽署知情同意書的條件下進行。依據TNM分期標準，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者分別為22、16、22例，且伴有淋巴結轉移者25例，無淋巴結轉移者35例，每例標本均有免疫組化法檢測的雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR）表達情況。

1.2 實驗方法

SIRT1鼠抗人單克隆抗體（一抗，工作濃度1∶400）及SPARC兔抗人單克隆抗體（一抗，工作濃度1∶200）均購自北京博奧森生物技術有限公司，免疫組化試劑盒、抗體稀釋液、PBS沖洗液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。免疫組化采用Envision法，組織標本依次經過常規切片，脫蠟入水，高壓修復，嚴格按照試劑盒說明書進行。以已知陽性切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定

經兩位有經驗的病理科專家對結果進行判定，SIRT1在細胞中陽性表達為黃色或棕黃色，SPARC在細胞中陽性表達為棕黃色［1］。根據染色程度及陽性細胞表達數進行評分：不著色記為0分，著色淡者記為1分，著色中等記為2分，著色深者記為3分，陽性細胞表達數：≤5%記為0分，＞5%～25%記為1分，＞25%～50%記為2分，＞50%記為3分；兩者得分乘積為最后得分。0～1分記為陰性（-），2～3分記為弱陽性（+），4～6分記為陽性（++），＞6分記為強陽性（+++）。在統計分析中將表達（-）～（+）劃分為低表達，（++）～（+++）劃分為高表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，SIRT1和SPARC的表達及其與臨床病理因素的分析采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SIRT1在乳腺癌和乳腺纖維腺瘤組織中的表達

免疫組化染色結果顯示（圖1，封三），SIRT1主要表達于乳腺癌腫瘤細胞的細胞核和細胞質中。在乳腺纖維腺瘤及乳腺癌中，SIRT1的陽性表達率分別為33.3%（5/15）及61.7%（37/60），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 SPARC在乳腺癌和乳腺纖維腺瘤組織中的表達

免疫組化染色結果顯示（圖2，封三），SPARC表達于腫瘤細胞、間質細胞的細胞質及細胞核中，以細胞質表達為主。SPARC在乳腺癌間質細胞的高表達率（73.3%，44/60）明顯高于乳腺癌腫瘤細胞（10.0%，6/60）和乳腺纖維腺瘤間質細胞（40.0%，6/15），差異均有統計學意義（P＜0.05）。提示SPARC在乳腺癌間質細胞中呈高表達，而在腫瘤細胞中呈現低表達。

2.3 乳腺癌組織中SIRT1的表達與臨床病理指標的關系

乳腺癌中SIRT1的表達與患者年齡、腫物大小、ER、PR等因素均無關（P＞0.05），但與TNM分期、腋窩淋巴結轉移有關（P＜0.05）。見表1。2.4乳腺癌組織中SPARC的表達與臨床病理參數的關系

表1 乳腺癌組織中SIRT1的表達與病理指標的關系（例）

乳腺癌中SPARC的表達與患者年齡、腫物大小、ER、PR、TNM分期均無關（P＞0.05），但與腋窩淋巴結轉移有關（P＜0.05）。見表2。

表2 乳腺癌組織中SPARC表達與臨床病理指標的關系（例）

3 討論

SIRTl是組蛋白脫乙酰酶（HDAC）第Ⅲ類蛋白質家族的成員之一，并且是NAD+依賴性組蛋白和蛋白脫乙酰基酶。SIRT1不僅可以通過組蛋白脫乙酰誘導染色質沉默，并且可以通過調節轉錄活性調節細胞存活，在細胞的生理及病理過程中起重要作用，如基因沉默、DNA損傷修復、腫瘤發生等［13］。SIRT1表達水平與腫瘤分期、淋巴結轉移有關。樊林等［14］研究認為，胃癌組織中SIRT1的表達較正常組織表達增高，且浸潤深度越深、有淋巴結轉移及臨床分期越高時，表達隨之升高。另有學者研究證明，SIRT1的高表達率在子宮內膜癌、肝癌、結直腸癌中明顯上升，且在子宮內膜中的表達水平與臨床分期呈正相關［15］，在結直腸癌中的表達與分期及淋巴結轉移呈正相關［16］，這可能與Wang等［17］發現的SIRT1是通過P13K/PTEN/AKT途徑促進惡性腫瘤的發生有關。后期進一步研究發現，STRT1還通過脫乙酰基作用調控著諸多與腫瘤關系密切的信號因子，進而影響著腫瘤的各種特性［18-20］。例如：Powell等［21］的研究表明SIRTl的缺失可誘導前列腺上皮內瘤變的發生，表明了SIRT1的抗腫瘤作用。但關于SIRT1在乳腺癌組織中的表達研究較為少見。本研究顯示，在乳腺纖維腺瘤中SIRT1的陽性表達率為33.3%，明顯低于乳腺癌中SIRT1的陽性表達率（61.7%），差異有統計學意義（P＜0.05），在有淋巴結轉移、TNM分期為Ⅲ期的乳腺癌中SIRT1的高表達率高于無淋巴結轉移、Ⅰ、Ⅱ期（P＜0.05），這與宋新峰［22］研究結果一致。SIRT1的表達與患者年齡、性別、腫物大小、ER、RP表達情況無關（P＞0.05）。提示SIRT1可作為乳腺癌的診斷、病程判斷、預示乳腺癌的惡性程度的重要參考指標。

SPARC是一種含有大量半胱氨酸（Cys）的酸性分泌蛋白，又稱骨連接蛋白（osteonec-fin）或基底膜40蛋白（BM40），編碼SPARC蛋白的基因位于人類染色體5q31.3～q32，包含10個外顯子，全長25.9 kb，為單拷貝基因［2］。SPARC蛋白的主要功能是阻止細胞黏附、促使細胞變形、改變細胞周期、調整細胞分化及抑制某些生長因子對細胞的刺激，還可以調節細胞外基質和基質金屬蛋白酶的產生，并能影響新生血管的生成［3］。SPARC具有明顯的組織特異性，已有研究表明，SPARC在轉移性黑色素瘤中呈現高表達，在絕大多數異常痣中呈現中等表達［4-5］；在前列腺癌的部分原發灶中呈現低表達或中等表達，在大部分前列腺癌轉移灶中高表達［6］，此外，SPARC在惡性腫瘤中的表達與淋巴結轉移有關。楊錫貴等［7］研究認為在有淋巴結轉移的食管鱗癌患者中，SPARC蛋白陽性表達率較無淋巴結轉移組升高；另有學者研究表明，在肺癌組織［8］及子宮內膜癌組織［9］中，SPARC的表達與淋巴結轉移呈負相關。學者將正常表達SPARC的小鼠和SPARC敲除小鼠進行比較，發現前者腫瘤的發生、發展、轉移明顯慢于后者。這可能與SPARC表達減少后影響ECM聚集，導致膠原沉著和纖維形成減少，抑制腫瘤細胞的黏附和遷移有關［10］。本研究結果表明，SPARC在乳腺癌組織和乳腺纖維腺瘤組織中表達存在差異性，在乳腺癌間質細胞的高表達率（73.3%）高于乳腺纖維腺瘤中高表達率（40.0%），兩者差異有統計學意義；在乳腺癌的間質細胞中SPARC的高表達率明顯高于腫瘤細胞（10.0%）（P＜0.05），這與張雪梅［11］研究結果相一致。乳腺癌中有淋巴結轉移的SPARC高表達率（96.0%）高于無淋巴結轉移（74.3%）（P＜0.05），這與孫孝媛等［4］研究結果一致。說明在有淋巴結轉移組中SPARC的表達強度可能與乳腺癌的浸潤轉移有關，這可能與Rotllant等［12］研究認為的SPARC通過溶解細胞黏著斑、促使細胞變圓、促進細胞骨架重排來完成其抗黏附作用，增加腫瘤的侵襲和轉移能力有關。SPARC在TNM分期為Ⅲ期的高表達率（94.4%）高于Ⅰ、Ⅱ期（76.3%），但差異無統計學意義（P＞0.05），考慮本研究納入乳腺癌患者例數較少，Ⅰ、Ⅱ期患者占63.3%。SPARC在乳腺癌組織中的表達是否與TNM分期有關，雖然本研究尚未得出具有統計學意義的結果，但可能隨著樣本量的增加，會出現有意義的結果。本研究結果表明，SPARC在乳腺癌中的表達與患者年齡、ER、PR、腫物大小、病理分期等因素無關，與淋巴結轉移有關。這些提示SPARC與乳腺癌的發生、發展、侵襲和轉移有關。

綜上所述，SIRT1、SPARC在乳腺癌組織中均呈高表達。SIRT1和SPARC均參與了乳腺癌的發生、發展和轉移，兩者之間的具體作用機制及兩者之間是否存在相關性仍有待進一步研究。

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Expression and significance of SIRT1 and SPARC in breast invasive ductal carcinoma tissues

GAO Linlu1Y U Guohua2ZHANG Jumin2
1.Graduate School,Weifang Medical College,Shandong Province,Weifang 261000,China;2.Weifang People's Hospital,Shandong Province,Weifang 261000,China

ObjectiveTo explore the expressions and role of SIRT and SPARC in invasive ductal carcinoma of the breast.Methods60 samples of pathologically diagnosed breast invasive ductal carcinoma and 15 samples of bresat fibroadenomastromal tissues in Weifang People's Hospital from January to June 2014 were selected,the expressions of SIRT1 and SPARC in these samples were detected by immunohistochemical technique.ResultsSIRT1 positive expression rate in breast cancer cells(61.7%,37/60)was significantly higher than that in breast fibroadenoma(33.3%,5/15), the difference was statistically significant(P＜0.05);SIRT1 higher expression rate in invasive ductal carcinoma with lymph node metastasis(72.0%,18/25)was higher than that without lymph node metastasis(25.7%,9/35),the SIRT1 higher expression rate in TNMⅢ(77.3%,17/22)was significantly higher than that in TNMⅠ,Ⅱ(26.3%,10/38),the differences were statistically significant(P＜0.01).SPARC higher erexpression rate in breast cancer interstitial cells (73.3%,44/60)was significantly higher than those in breast cancer tumor cells(10.0%,6/60)and bresat fibroadenomastromal interstitial cells(40.0%,6/15),the differences were statistically significant(P＜0.05).SPARC higher expression rate in breast cancer with lymph node metastasis(96.0%,24/25)was higher that that without lymph node metastasis (74.3%,26/35).ConclusionThe higher expression of SIRT1 and SPARC in breast cancer are involved in breast cancer occurrence,development and prognosis.

Breast cancer,Breast neoplasms;SIRT1;SPARC

R737.9

A

1673-7210(2015）01(c）-0015-04

高琳璐，女，山東淄博人，濰坊醫學院2012級腫瘤學專業在讀碩士研究生；研究方向：惡性腫瘤的臨床和基礎研究。

于國華，男，山東濱州人，主任醫師，教授，碩士研究生導師，主要從事腫瘤的臨床和基礎研究工作。

2014-10-14本文編輯：蘇暢）