響應(yīng)面試驗優(yōu)化萬壽菊花中葉黃素酯皂化反應(yīng)工藝

馬空軍，潘言亮，張衛(wèi)紅，徐素梅，高 超

（1.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830046）

響應(yīng)面試驗優(yōu)化萬壽菊花中葉黃素酯皂化反應(yīng)工藝

馬空軍1，潘言亮2，張衛(wèi)紅1，徐素梅1，高 超1

（1.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，新疆 烏魯木齊 830046）

以葉黃素酯為原料，對萬壽菊花中葉黃素酯皂化反應(yīng)的工藝進行優(yōu)化，考察反應(yīng)溶劑種類及用量、皂 化溫度、皂化時間等因素對皂化反應(yīng)的影響，采用薄層層析法計算皂化率，確定葉黃素酯皂化的適宜操作條件，對皂化反應(yīng)工藝進行單因素試驗和響應(yīng)面分析研究。結(jié)果表明，葉黃素酯的皂化反應(yīng)最佳工藝條件為葉黃素酯為2.0 g時，無水乙醇用量31.3 mL、皂化溫度60℃、KOH用量2.1 g、皂化時間4 h，此條件下葉黃素酯的平均皂化率為78.4%。

葉黃素酯；皂化反應(yīng)；薄層層析法

葉黃素是一種廣泛存在于蔬菜、水果和花草植物中的主要類胡蘿卜素[1]，植物萬壽菊花中的葉黃素主要以酯類形式[2-3]存在，以酯形式存在的葉黃素不易被人體和動物吸收，而游離葉黃素可被人體和禽類直接吸收利用[4-5]，為了擴大其藥用性，對所提取的葉黃素酯進行皂化處理[6-8]成為獲取高純度游離葉黃素必不可少的環(huán)節(jié)[9-11]。

已有報道的文獻采用高效液相色譜法[12-16]分析皂化率，該分析方法準確率高，但是對試劑的要求很苛刻，只能選取色譜純，且操作費用高。薄層色譜分析是一種固-液吸附色譜分離技術(shù)[17]，該方法具有操作簡便、分離快、同時分離多個樣品、樣品易處理、成本低等特點。正是由于這些特點，使得薄層色譜在天然產(chǎn)物的提取分離上有廣泛應(yīng)用[18]。本研究以萬壽菊中所提取的葉黃素酯為研究對象，進行皂化處理，探索葉黃素酯皂化反應(yīng)的最佳工藝路線和最佳工藝參數(shù)，為提取高純度游離態(tài)的葉黃素提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

葉黃素酯粗提物為經(jīng)正己烷提取萬壽菊產(chǎn)物。

薄層層析硅膠（G F 2 5 4）、硅膠板（25.4 mm×76.2 mm×0.2 mm） 青島海洋化工有限公司；玻璃點樣毛細管（100 mm×0.5 mm） 華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠；無水乙醇 天津永晟精細化工有限公司；正己烷、乙酸乙酯、氫氧化鈉、無水硫酸鈉 天津市百世化工有限公司；石油醚 天津市富宇精細化工有限公司；羧甲基纖維素鈉（LH9，800-1200） 上海山浦化工有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

電子天平、TDL-50B離心機 上海精密科學(xué)儀器有限公司；DF-101Z型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海洪紀儀器有限公司；DZF-6030A真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；U-3900型紫外分光光度計 日本日立公司。

1.3方法

1.3.1工藝流程

葉黃素酯皂化反應(yīng)工藝流程見圖1。

圖1 葉黃素酯皂化反應(yīng)工藝流程圖Fig.1 Flow diagram for the saponification of lutein esters

1.3.2皂化率的計算

在葉黃素酯的皂化反應(yīng)中，隨著反應(yīng)的不斷進行，葉黃素酯逐漸水解為葉黃素和脂肪酸鹽，通過觀察色譜板上斑點的變化，來分析皂化反應(yīng)發(fā)生的程度。對皂化得到的葉黃素和未皂化的葉黃素酯進行紫外測試[19-20]，并按下式計算皂化率：

式中：A1為皂化前少量葉黃素含量/g；A2為皂化后的葉黃素含量/g；A3為未皂化完的葉黃素酯類含量/g。

1.3.3單因素試驗

針對葉黃素酯的皂化反應(yīng)中各種條件（溶劑的選擇、堿量的選取、皂化反應(yīng)的溫度以及時間）對萬壽菊中葉黃素酯皂化程度的影響，采用單因素試驗進行研究分析，用皂化率評價試驗的工藝參數(shù)。

1.3.3.1溶劑種類及用量的影響

稱取質(zhì)量為2 g（準確到0.001 g，下同）萬壽菊葉黃素酯5份于250 mL的三口瓶中，均加入10 mL石油醚[21]為葉黃素酯的分散劑，再分別加入30 mL的甲醇、無水乙醇、乙二醇、丙醇、丙三醇，最后各加入2 g KOH和磁子，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，設(shè)置皂化溫度60℃、轉(zhuǎn)速30 r/min、皂化時間4 h，選出最佳的溶劑，同時考察醇的用量對皂化的影響。

1.3.3.2KOH用量的影響

稱取質(zhì)量為2 g葉黃素酯5份于250 mL的三口瓶中，石油醚用量10 mL、無水乙醇用量30 mL，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，設(shè)置皂化溫度60℃、轉(zhuǎn)速30 r/min、皂化時間4 h，研究KOH用量1、2、3、4、5 g時對葉黃素酯皂化效果的影響。

1.3.3.3皂化時間的影響

稱取質(zhì)量為2 g葉黃素酯5份于250 mL的三口瓶中，石油醚用量10 mL、無水乙醇用量30 mL、KOH用量2 g，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，設(shè)置皂化溫度60℃、轉(zhuǎn)速30 r/min，研究皂化時間1、2、3、4、5 h對葉黃素酯皂化效果的影響。

1.3.3.4皂化溫度的影響

稱取質(zhì)量為2 g葉黃素酯5份于250 mL的三口瓶中，石油醚用量10 mL、無水乙醇用量30 mL、KOH用量2 g，置于集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，設(shè)置轉(zhuǎn)速30 r/min、皂化時間4 h，考慮到石油醚的沸程為60～90℃和無水乙醇的沸點為78℃，研究皂化溫度為室溫（22℃）、30、40、50、60℃時葉黃素酯的皂化效果。

1.3.4響應(yīng)面法優(yōu)化葉黃素酯皂化工藝參數(shù)

通過單因素試驗，選擇無水乙醇作為皂化劑，固定皂化時間為4 h，以無水乙醇用量（X1）、皂化溫度（X2）和KOH用量（X3）3個因素與葉黃素酯的皂化率進行響應(yīng)面試驗設(shè)計（表1），優(yōu)化葉黃素酯的皂化工藝。通過Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，確定最佳工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

2.1.1溶劑種類及用量的選擇

圖2 皂化溶劑種類對皂化率的影響Fig.2 Effect of different solvents on the saponification rate of lutein esters

由圖2可知，溶劑的皂化能力大小順序為甲醇＞無水乙醇＞丙醇＞乙二醇＞丙三醇，皂化結(jié)果表明，黏度的大小對皂化程度有很大的影響，黏度越小，皂化反應(yīng)的傳質(zhì)阻力會越小，反之，黏度最大的丙三醇，皂化率只有8.1%，幾乎沒發(fā)生反應(yīng)，故應(yīng)選擇黏度小溶劑。在保證皂化率的同時，考慮到葉黃素的應(yīng)用和溶劑的安全、低毒，而甲醇有一定的毒性，選取無水乙醇作為皂化劑。

圖3 無水乙醇用量對皂化率的影響Fig.3 Effect of absolute ethanol volume on the saponification rate of lutein esters

保持其他條件不變，固定皂化溶劑為無水乙醇，改變其用量。如圖3所示，初始階段葉黃素酯的皂化率隨無水乙醇用量的增加幅度變化較大，當無水乙醇用量從10 mL增加到20 mL，皂化率提高了13.6%，皂化程度相比無水乙醇量為10 mL時提高了25%；無水乙醇用量達到30 mL后，每增加10 mL無水乙醇量，皂化率的提高值不超過5%，皂化率增加的幅度出現(xiàn)了降低的趨勢。原因可能為無水乙醇用量增加使葉黃素得到了充分分散，增大了反應(yīng)物之間的接觸，從而提高了反應(yīng)的傳質(zhì)速率，使得皂化比較完全。無水乙醇用量的增加在提高皂化率同時，也勢必提高了生產(chǎn)成本，給后續(xù)處理造成困難，故無水乙醇用量選擇30 mL較適宜。

2.1.2 KOH用量的選擇

圖4 KOH用量對皂化率的影響Fig.4 Effect of KOH concentration on the saponification rate of lutein esters

如圖4所示，在1～2 g范圍內(nèi)，KOH用量的增加對葉黃素酯的皂化有很大程度的影響，皂化率增大值約為10%，繼續(xù)增大其用量，對皂化的程度不再有較大的影響，同時考慮到皂化后的剩余堿量的處理，需要大量的水洗去除，對葉黃素產(chǎn)品有一定的損失。故KOH用量選擇為2 g左右。

2.1.3皂化時間的選擇

由圖5可知，反應(yīng)時間在0～4 h范圍內(nèi)，皂化率隨時間的延長逐漸升高，當反應(yīng)時間為4 h時，皂化率達到了最大，之后再延長時間，皂化率出現(xiàn)了減小的趨勢。故選擇反應(yīng)時間為4 h左右。

圖5 皂化時間對皂化率的影響Fig.5 Effect of saponification time on the saponification rate of lutein esters

2.1.4皂化溫度的選擇

圖6 皂化溫度對皂化率的影響Fig.6 Effect of saponification temperature on the saponification rate of lutein esters

由圖6可知，隨著皂化溫度的升高，皂化率呈現(xiàn)“S”形的增加。這一結(jié)果與酯類的皂化屬于吸熱反應(yīng)一致，根據(jù)反應(yīng)熱力學(xué)，升高溫度增大了反應(yīng)速率常數(shù)[22]，從而有利于葉黃素酯的皂化反應(yīng)。但是葉黃素酯皂化生成的游離態(tài)葉黃素熱不穩(wěn)定[23]，溫度升高在增大反應(yīng)速率的同時，可能會出現(xiàn)降解或者異構(gòu)化等反應(yīng)的發(fā)生，致使增加的幅度出現(xiàn)了降低的趨勢。綜合考慮設(shè)置溫度為60℃。

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化葉黃素酯皂化工藝結(jié)果

表2 皂化反應(yīng)工藝響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental results of response surface analysis for optimizing the saponification of lutein esters

以無水乙醇用量、皂化溫度、KOH用量為自變量，葉黃素酯的皂化率為響應(yīng)值，按響應(yīng)面試驗設(shè)計，平行試驗3次所得的平均值為響應(yīng)值，結(jié)果見表2，響應(yīng)面圖和等高線見圖7。

圖7 各因素交互作用對萬壽菊花中葉黃素酯皂化效果影響的響應(yīng)面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of saponification temperature and KOH concentration on the saponification rate of lutein esters

由圖7A可知，無水乙醇用量和皂化溫度的交互作用對葉黃素酯皂化反應(yīng)有一定影響。無水乙醇用量不變時，皂化率隨著溫度的升高而增加；皂化溫度一定時，葉黃素皂化率先逐漸增加，達到極大值后逐漸下降。通過等高線的疏密可以判斷在交互影響中皂化溫度對響應(yīng)值的影響大于無水乙醇用量。由圖7B可知，無水乙醇用量一定時，皂化率隨著KOH用量增加而增大，達到極大值后對皂化的程度影響不顯著。KOH用量一定時，皂化率隨著無水乙醇用量增加而增加，當無水乙醇用量增加到一定值后，皂化率增幅呈逐漸下降的趨勢。由圖7C可知，皂化溫度不變時，葉黃素皂化率隨著KOH用量增加而增加，當KOH用量增加到一定值后，葉黃素皂化率呈逐漸下降的趨勢。KOH用量不變時，葉黃素皂化率隨著皂化溫度的升高而增加，但超過一定值后溫度的升高對葉黃素皂化率的影響不顯著。

由圖7可以直觀地看出，無水乙醇用量和KOH用量之間的交互作用對葉黃素提取皂化效果影響顯著，而KOH用量和皂化溫度的交互作用次之，表現(xiàn)在曲面比較陡，并且等高線呈現(xiàn)橢圓狀；皂化溫度和無水乙醇用量之間的交互作用對葉黃素提取皂化效果影響不顯著，表現(xiàn)在曲面比較平滑。

2.3方差分析結(jié)果

使用Design-Expert 8.0.6軟件對表2響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得出皂化率Y與自變量X1、X2、X3的二次回歸方程：

Y=78.24+0.99X1+1.05X2+1.16X3-0.48X1X2+0.35X1X3-0.13X2X3-1.17X12+0.41X22-2.92X32

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

表3分析結(jié)果表明，回歸模型P＜0.000 1，說明該二次方程模型極其顯著，失擬項P=0.089 5＞0.05，說明失擬項不顯著，回歸模型的決定系數(shù)為R2=0.944 2，說明該二次方程模型與數(shù)據(jù)擬合程度較好，試驗隨機誤差及噪聲的波動影響較小，可以用上述二次回歸方程分析和預(yù)測葉黃素酯皂化反應(yīng)的工藝參數(shù)。

此外，回歸系數(shù)顯著性檢驗表明，在所選擇的各因素水平范圍內(nèi)，對影響葉黃素酯皂化反應(yīng)的因素排序：KOH用量（X3）＞皂化溫度（X2）＞無水乙醇用量（X1）。回歸方程各項的方差分析結(jié)果表明，一次項X1、X2、X3及二次項X12、X32對葉黃素酯皂化反應(yīng)效果的影響較顯著，X1X2、X1X3、X2X3、X22對葉黃素酯皂化反應(yīng)效果的影響不顯著。

由Design-Expert 8.0.6軟件分析出萬壽菊葉黃素酯皂化反應(yīng)的最佳工藝條件編號為：X1=0.25、X2=1、X3=0.19。轉(zhuǎn)化成的最佳工藝參數(shù)為：無水乙醇用量31.25 mL、皂化溫度60℃、KOH用量2.1 g。在此條件下，葉黃素酯的理論皂化率為79.86%。選擇無水乙醇用量31.3 mL、皂化溫度60℃、KOH用量2.1 g、皂化時間4 h，選擇進行3次平行實驗，得出葉黃素酯的實際皂化率為78.4%。與理論預(yù)測值誤差僅為-1.8%，驗證結(jié)果與預(yù)測值偏差很小，說明采用響應(yīng)面分析所得到的工藝條件是簡便可行。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)面數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，得出萬壽菊葉黃素酯皂化反應(yīng)的最佳工藝條件為無水乙醇用量31.3 mL、皂化溫度60℃、KOH用量2.1 g、皂化時間4 h，進行3次平行實驗，得出葉黃素酯的實際皂化率為78.4%。驗證結(jié)果與預(yù)測值偏差很小，說明采用響應(yīng)面分析葉黃素酯皂化工藝條件簡便可行。

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Optimizing the Saponification of Lutein Esters from Marigold Flowers

MA Kongjun1, PAN Yanliang2, ZHANG Weihong1, XU Sumei1, GAO Chao1

(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, ?rümqi 830046, China; 2. Institute of Applied Chemistry, Xinjiang University, ?rümqi 830046, C hina)

This work was conducted to investigate the saponification of lutein esters from marigold flowers. The effects of type and amount of organic solvent, saponification temperature and time on the saponification rate of lutein esters as determined by thin layer chromatography were explored. The optimal conditions for the saponification of lutein esters were determined by single factor experiment and response surface analysis as follows: 2.0 g of lutein esters, 31.3 mL of absolute ethanol, 2.1 g of potassium hydroxide, a saponification temperature of 60 ℃, and a saponification duration of 4 hours. Under these optimal conditions, the average saponification rate of lutein esters reached 78.4%.

lutein esters; saponification; thin layer chromatography

TS202.1

A

1002-6630（2015）12-0007-05

10.7506/spkx1002-6630-201512002

2014-10-11

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（21166023）；新疆自治區(qū)重點技術(shù)創(chuàng)新項目

馬空軍（1969—），男，副教授，博士，研究方向為化工傳質(zhì)與分離。E-mail：kjma@xju.edu.cn