響應面試驗優化阿魏?；觉；Y構酯合成工藝及產物穩定性

王 強，龍 潔，任彥榮，王 存，彭 榮，袁 君

（1.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067；2.西南大學食品科學學院，重慶 400715；3.重慶工商大學環境與生物工程學院，重慶 400067；4.普研（上海）標準技術服務有限公司，上海 201210）

響應面試驗優化阿魏?；觉；Y構酯合成工藝及產物穩定性

王 強1,2，龍 潔1，任彥榮1，王 存1，彭 榮3，袁 君4

（1.重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067；2.西南大學食品科學學院，重慶 400715；
3.重慶工商大學環境與生物工程學院，重慶 400067；4.普研（上海）標準技術服務有限公司，上海 201210）

利用響應面試驗對在溶劑體系中脂肪酶Lipozyme RM IM催化玉米胚芽油與阿魏酸酸解制備阿魏?；觉；Y構酯的反應條件進行優化。在搖床轉速為220 r/min的條件下，選取投料比（阿魏酸與玉米胚芽油質量比）、反應溫度、反應時間3個因素作為考察對象，以阿魏酸轉化生成阿魏酰基脂肪?；Y構酯的得率為考察指標，運用Design-Expert軟件的星點設計功能進行試驗設計并對結果進行分析。結果表明，3個因素均為影響阿魏酸酯化的顯著因素；經響應面分析可確定最優值為投料比8.9∶1（g/g）、反應溫度76.0℃、反應時間28.1 h。該條件下的平均得率達59.1%，與響應面擬合方程的得率預測值58.8%吻合良好。在煎炸過程中新制備的結構酯產生較低的聚合物，同時其具有較高的貯藏穩定性。

阿魏酸；阿魏酰基脂肪酰基結構酯；響應面優化；穩定性

阿魏酸化學名為4-羥基-3-甲氧基-2-苯丙烯酸，在植物細胞壁中，與多糖和木質素交聯構成細胞壁的一部分，是阿魏、當歸、川芎、升麻等中藥的有效成分之一，其熔點為174℃，阿魏酸微溶于冷水，可溶于熱水，水溶液中穩定性差，見光易分解，易溶于乙醇等極性較強有機溶劑[1-2]?，F代藥理學研究表明，阿魏酸具有明顯的抗氧化、清除自由基、抗感染和神經保護作用[3-4]。但是，阿魏酸應用存在一些問題，例如，阿魏酸脂溶性較差，限制其在油脂基食品、醫藥、及化妝品中應用[3,5]。因此，將阿魏酸與一些脂溶性較強分子相結合，既可保持其生物活性，還可增強其親脂性，從而擴大其應用范圍。國內外研究[6-8]發現，將天然抗氧化性成分制備成改性結構脂質后，可顯著地提高天然抗氧化性成分的應用范圍。

目前研究較多的阿魏酸脂溶性衍生物是阿魏酰基脂肪?；Y構酯，研究表明，經分子改性的阿魏?；觉；Y構酯表現出比阿魏酸更強脂溶性，并保持阿魏酸生物活性，如抗氧化、抗紫外吸收等功效[9-13]。研究發現，溶液體系、投料比例和反應條件等因素均對合成阿魏?；觉；Y構酯具有顯著影響[14-17]。因此，本研究采用脂肪酶Lipozyme RM IM在甲基乙基酮溶劑體系中催化阿魏酸和玉米胚芽油酯交換合成阿魏?；觉；Y構酯，通過響應面試驗設計對該體系中酶催化酯交換合成阿魏酰基脂肪?；Y構酯的條件進行優化，并考察投料比（阿魏酸與玉米胚芽油質量比）、反應溫度、反應時間3個因素對產物得率的影響，確立了一個新的反應時間短、得率高的合成路徑和方法；在此基礎上，研究了產物在煎炸和貯藏等環境下的穩定性，實驗結果揭示該工藝合成的阿魏酰基脂肪酰基結構酯在高溫煎炸和長期貯藏過程中具有較高穩定性。通過脂肪酶Lipozyme RM IM在甲基乙基酮溶劑體系中催化阿魏酸和玉米胚芽油酯交換合成阿魏?；觉；Y構酯，不僅沒有丟失阿魏酸的功能特性，還提高了其功能，拓寬其應用領域，提高應用效果。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

玉米胚芽油 益海嘉里（重慶）糧油有限公司；阿魏酸、脂肪酶Lipozyme RM IM諾維信（中國）生物技術有限公司；甲基乙基酮、其他試劑（均為分析純） 成都科龍試劑廠；所用水為雙蒸水，所用溶液均自行配制。

1.2儀器與設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省鞏義市予華儀器有限公司；AR1140電子分析天平 美國奧豪斯貿易公司；DSY-Ⅲ氮吹儀 金科精華苑科技有限公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配備有ZORBX-SB ODS色譜柱（4.6 mm×250 mm，0.45μm）、蒸發光散射檢測器和紫外檢測器） 美國Agilent公司。

1.3方法

1.3.1酯交換反應

稱5.0 g玉米胚芽油和適量阿魏酸加入到50 mL具塞錐形瓶中，在甲基乙基酮為溶劑條件下，按照一定投料比（4∶1～10∶1）合成阿魏?；觉；Y構酯，當達到預定反應溫度（60～80℃）時，加入12%（占底物質量分數）的脂肪酶Lipozyme RM IM（來自于黑根毛霉Rhizomucor miehei），在轉速200 r/min條件下，密閉振蕩反應（20～30 h）。定時取樣，考察投料比、反應溫度、反應時間3個因素對產物得率的影響。

1.3.2響應面優化酯化制備工藝

在單因素試驗基礎上，采用響應面法對影響阿魏酰基脂肪酰基結構酯制備的主要因素投料比（A）、反應溫度（B）、反應時間（C）進行優化。每個因素設計5個水平，分別用代碼-α、-1、0、1、α（α=1.732）表示，因素水平見表1。

表1 星點試驗設計因素與水平表Table 1 Factor and levels used in central composition design

1.3.3 反應產物分離和HPLC分析

反應混合物離心，除去脂肪酶。取一定質量的樣品離心后，加入30 mL正己烷和10 mL 0.8 mol/L的KOH醇水溶液（30%乙醇），劇烈振蕩2 min，靜置5 min。下層醇水溶液再加入15 mL正己烷二次提取，劇烈振蕩2 min，靜置。合并兩次萃取所得上清液，旋轉蒸發去除有機溶劑（40℃），所得樣品稱質量，冰箱保存用于后續分析[18]。

H P L C條件：色譜柱：N o v a-P a k C18柱（3.9 mm×150 mm，4.6μm）；流動相由0.75%冰醋酸（A）和甲醇（B）組成，起始流動相為50%A和50%B，流動相比例變為90%A和10%B 10 min，然后變為100%B 40 min；流速為1 mL/min；洗脫液在325 nm波長條件下檢測。

1.3.4煎炸實驗和聚合物含量的測定

參考李東銳等[19]報道的煎炸實驗方法。油脂中二聚物和高聚物含量可用高效體積排阻色譜來測量；操作參數：柱的選擇：PLGEL（30 cm×0.8 cm，0.25μm）；流動相：HPLC純的四氫呋喃；流速：0.85 mL/min；操作柱溫：35℃；注射量：20 mL油和四氫呋喃（1∶1，V/V）。在相同檢測器響應的條件下，聚合物總含量以峰面積為基準進行計算。

1.3.5加速氧化測試

采用Schall烘箱法加熱加速氧化實驗。分別取20 mL原始玉米胚芽油和改性結構酯裝入100 mL透明玻璃瓶，密封后避光放置于65℃恒溫培養箱中加熱加速氧化5 d，每隔24 h測定樣品體系的過氧化值和β-茴香胺值，所有樣品測定3次。過氧化值按GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛生標準的分析方法》測定[20]。β-茴香胺值測定參照GB/T 24304—2009《動植物油脂：茴香胺值的測定》[21]。

1.4數據統計分析

采用SPSS 17數據處理軟件，各組數據結果均以（n=3）表示，并進行方差分析，最小顯著性法進行多重比較，P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1響應面優化結構酯制備工藝條件

2.1.1回歸方程與方差分析

表2 星點試驗設計與結果Table 2 Central composite design with response values

試驗利用Design-Expert 7.1.6軟件中的星點試驗設計，可獲得阿魏?；觉；Y構酯得率（Y）的三因素三水平試驗設計及結果（表2）。對表2中的結果進行統計分析，可建立如下二次回歸方程：

對二次回歸方程進行方差分析，結果見表3。從表3可知，阿魏?；觉；Y構酯得率Y的A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2均表現出了顯著水平，僅AC項不顯著。進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗發現，模型的決定系數R2為0.971 9，表明預測值和實測值之間的相關性很好?；貧w模型P＜0.000 1，極顯著；表3中，失擬項P＞0.05，不顯著，因此證明該模型可以充分地解釋響應中的變異，模型擬合度良好。

表3 阿魏酰基脂肪?；Y構酯得率回歸方程的方差分析表Table 3 Analysis of variance for the yield of feruloylated acylglycerols

2.1.2響應面分析

圖1 各因素交互作用對阿魏酰基脂肪?；Y構酯得率的影響Fig.1 Influence of reaction conditions on the yield of feruloylated acylglycerols

為了考察投料比（A）、反應溫度（B）、反應時間（C）及其交互作用對結構酯得率（Y）的影響，固定其他因素條件不變，獲得任意2個因素及其交互作用對得率（Y）影響的響應面圖，結果如圖1所示。交互作用與阿魏酰基脂肪?；Y構酯得率均為正相關關系，二因素交互作用的重要性由AB、BC、AC依次遞減。

2.1.3響應面分析和優化參數驗證

分析結果表明，回歸模型存在穩定點編碼值（0.633、0.595、0.627），穩定點的特征值表明，穩定點為阿魏?；觉；Y構酯得率最大值點，即投料比8.9∶1、反應溫度76.0℃、反應時間28.1 h。該條件下的平均得率達（59.1±0.86）%，與響應面擬合方程的得率預測值58.8%吻合良好。該酶法催化阿魏酸和玉米胚芽油直接制備阿魏酰基脂肪?；Y構酯的反應條件溫和、催化效率高、催化劑可重復利用。Compton等[22]研究了Novozyme 435酶在無溶劑體系條件下催化阿魏酸乙酯與大豆油酯交換合成阿魏酸甘油酯，結果表明，阿魏酸甘油酯的產率為60%。

2.2改性處理對玉米胚芽油煎炸過程中聚合物含量的影響

圖2 改性處理對玉米胚芽油在煎炸過程中聚合物含量的影響Fig.2 Effects of modification on the polymer content of maize germ oil during frying

油炸過程中產生的聚合物包括二聚體化合物、三聚體化合物和高分子化合物等，聚合物含量是衡量油脂中發生氧化聚合和熱聚合形成聚合產物多少的重要指標，聚合物的產生影響了油的品質，同時還影響了食品的水分損失和吸油情況[23-24]。如圖2所示，在煎炸過程中，改性處理降低了玉米胚芽油的聚合物生成，表明該工藝改性的結構脂質具有較高的氧化穩定性。通過對原始玉米胚芽油和阿魏?；觉；Y構酯在煎炸過程中聚合物指標所發生的變化研究，對進一步探討如何減緩油脂煎炸過程中氧化變質和如何延長煎炸食品的貨架壽命具有重要的意義。

2.3改性處理對玉米胚芽油過氧化值和β-茴香胺值的影響

過氧化值是油脂初始氧化反應的產物，大部分初始氧化產物都分解成酮醛等有害物質；而β-茴香胺值反映的是油脂氧化時二次氧化產物的含量，是評價油脂二次氧化最好的方法[25]。圖3A顯示，改性前后樣品過氧化值均隨時間延長而增大，但過氧化值變化趨勢有明顯差異。0～5 d范圍內，空白對照組試樣過氧化值隨時間延長而顯著增大，而改性處理可以顯著改善玉米胚芽油在高溫中的氧化穩定性。β-茴香胺值隨著貯藏時間的變化規律如圖3B所示，隨著高溫貯藏時間的延長，各種樣品的β-茴香胺值均呈增大趨勢，與空白樣品對比，改性處理對玉米胚芽油有抗氧化作用。從以上結果可以看出，通過對玉米胚芽油改性，該結構脂質具有傳統油脂的營養和物理性能，而且最大限度地發揮了油酸和亞油酸功效，提高了氧化穩定性與貨架期內的品質，是一種可替代傳統油脂使用的高品質結構脂質。

圖3 改性處理對玉米胚芽油的過氧化值（A）和β-茴香胺值（B）的影響Fig.3 Effects of modification on the peroxide value (A) and β-anisidine value (B) of maize germ oil

3 結 論

通過對響應面試驗的優化分析，得出3個反應因素對阿魏?；觉；Y構酯得率影響大小的順序為：反應溫度＞反應時間＞投料比。并且獲得在甲基乙基酮溶劑體系中酶法催化玉米胚芽油交換合成阿魏?；觉；Y構酯的最佳工藝條件為：投料比8.9∶1、反應溫度76.0℃、反應時間28.1 h。在此工藝條件下可獲得阿魏?；觉；Y構酯得率為59.1%。穩定性實驗研究發現，經過阿魏酸酯化改性后，玉米胚芽油結構脂質表現出較高的煎炸穩定性和耐高溫貯藏穩定性。采用脂肪酶Lipozyme RM IM合成阿魏?；觉；Y構酯是一種高效、專一性強、副產物少、環境友好的工藝技術，可用于阿魏?；觉；Y構酯的放大實驗。

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④請同學們具體嘗試一下.(將△BPC繞著點C順時針旋轉60°到△AQC位置，連接PQ，由等邊△PCQ有∠QPC=60°，由AP2+PQ2=AQ2有∠APQ=90°，所以∠APC=150°)

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Optimized Synthesis and Stability of Feruloylated Acylglycerols

WANG Qiang1,2, LONG Jie1, REN Yanrong1, WANG Cun1, PENG Rong3, YUAN Jun4
(1. Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China; 2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. College of Environmental and Biological Engineering, Chongqing Technology and Business University, Chongqing 400067, China; 4. Gratech Co. Ltd., Shanghai 201210, China)

This study was intended to model and optimize the reaction conditions for enzymatic esterifi cation of ferulic acid withmaize germ oil using a commercial lipase, Lipozyme RM IM, in a solvent system toobtain feruloylated acylglycerols by response surface methodology (RSM). The experiments were designed with central composite design. The reaction factors investigated were molar ratioof maize germ oilto ferulic acid, temperature and time. The yield of feruloylated acylglycerols was selected as the response variable. All the factors investigated signifi cantly affected the yield of feruloylated acylglycerols. The optimal reaction conditions were found to be a molar ratioof maize germ oilto ferulic acid of 8.9:1 (g/g),76.0℃and 28.1 h, leading to a feruloylated acylglycerol yield of59.1%, which was in good agreement with the predicted value of58.8%. The prepared acylglycerols produced low polymer during frying process, and they had high storage stability.

ferulic acid;feruloylated acylglycerols; response surface methodology; stability

R151；TQ925

A

1002-6630（2015）12-0017-05

10.7506/spkx1002-6630-201512004

2014-11-25

國家自然科學基金青年科學基金項目（31401559）；重慶市應用開發計劃項目（cstc2014yykfA80009）；重慶市教委科學技術研究項目（KJ1401418）；重慶第二師范學院創新團隊項目（KYC-cxtd03-20141002）作者簡介：王強（1982—），男，副教授，博士研究生，研究方向為油脂化學、抗氧化自然資源利用與生理生化。

E-mail：wangqiang8203@163.com