響應面試驗優化新疆野生準噶爾山楂殘渣中多糖純化工藝

（新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 8 30054）

響應面試驗優化新疆野生準噶爾山楂殘渣中多糖純化工藝

張 玉，李 進*，呂海英，張 俠，張花麗

（新疆特殊環境物種保護與調控生物學實驗室，新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 8 30054）

為純化準噶爾山楂殘渣中的粗多糖，通過動態吸附和洗脫實驗從7 種大孔吸附樹脂中選出兩種最優樹脂NKA-9和D101，按一定比例進行混合實驗。在單因素試驗基礎上，利用響應面法確定最佳純化條件：NKA-9與D101樹脂最佳混合質量比為2∶3；最佳吸附工藝條件為上樣液流速3.75 mL/min、上樣液質量濃度1.32 g/L、樹脂徑高比1∶13，此條件下多糖的吸附率為60.75%；最佳洗脫工藝條件為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.5 mL/min、洗脫液用量7 BV，此條件下多糖的洗脫率為84.22%。樣品中 多糖含量由原來的5.06%上升至21.13%。

準噶爾山楂；多糖；響應面法；精制工藝

多糖又稱多聚糖，是由多個單糖聚合而成的天然高分子化合物，在動植物體內廣泛存在，分布極廣[1-3]，植物多糖由于其具有調節免疫、抗腫瘤、延緩衰老、降低糖脂等生物活性，在抗生素替代物及保健品領域已有很廣泛的應用[4-7]。

準噶爾山楂（ Crataegus songarica）是薔薇科山楂屬植物，是新疆特有落葉小喬木，現已被列為三級重點保護植物并被列入中國優先保護物種名錄，生長于河谷或干旱碎石坡地，海拔700～20 000 m，在中國大陸僅分布 于新疆霍城縣，在俄羅斯、阿富汗、伊朗等地也有分布，花期5～6 個月，果期7～8 個月[8]。研究表明，其果實中富含抗細胞氧化的黃酮類[9]、熊果酸[10]、天然花色苷[11]等，然而對于準噶爾山楂多糖的研究還未見報道。

大孔吸附樹脂是一種具有良好的大孔網狀結構和較大比表面積的高分子型吸附樹脂，與傳統吸附劑相比，它具有選擇吸附性強、解吸條件溫和、吸附量大、耐污染、使用壽命長、機械強度高、再生容易等優點，近年來我國將其作為中藥分離純化的常用方法[12-14]。

響應面法是采用多元二次回歸方程擬合響應項與響應值之間的函數關系，得到最優工藝條件的有效方法之一，目前，該分析方法已廣泛應用于食品工業[15-16]。

目前準噶爾山楂資源沒有被充分利用，其果實提取過花色苷后產生的大量殘渣通常被直接丟棄，前期實驗發現這些殘渣中含有大量多糖類物質。本實驗以提取過花色苷的準噶爾山楂殘渣為原料提取多糖，利用響應面法優化多糖精制工藝，為更高效地利用新疆特有準噶爾山楂資源提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

準噶爾山楂成熟果實采于新疆伊犁，已提取過花色苷，粉末60℃烘干、過篩備用。

D101、NKC-9、NKA-9、YPR-Ⅱ、S-8、CAD-40、HPD100樹脂 天津南開合成科技有限公司。

1.2儀器與設備

RV10自動控制型立式旋轉蒸發儀 德國IKA集團；VIS-7220紫外-可見分光光度計、DZF-6021型真空干燥箱上海恒平科學儀器有限公司；SHA-CA數顯水浴恒溫振蕩器 天津賽得利斯實驗分析儀器廠；AUY220電子天平 日本島津公司。

1.3方法

1.3.1準噶爾山楂粗多糖的制備

采用水提醇沉法[17]。取5 g山楂粉末于200 mL蒸餾水中90℃熱水浸提60 min，浸提液減壓濃縮，雙氧水氧化脫色，Sevag試劑除蛋白后4 000 r/min離心10 min，取上清液，加5倍體積的95%乙醇溶液，冰箱靜置24 h后減壓抽濾分離絮狀沉淀，乙醇、丙酮淋洗3次后于60℃恒溫箱烘干，得粗多糖。經苯酚-硫酸法測定，多糖含量為5.06%。

1.3.2大孔樹脂的預處理[18]

使用95%乙醇溶液將樹脂充分浸泡24 h后用無水乙醇洗滌至無白色混濁出現，用蒸餾水沖洗樹脂無醇味，后分別用5%HCl溶液、5%NaOH溶液浸泡3 h，用蒸餾水洗至pH值為中性。

1.3.3大孔樹脂的篩選

選用7種不同型號的樹脂：D101、NKC-9、NKA-9、YPR-Ⅱ、S-8、CAD-40和HPD100樹脂，準確稱取5.0 g預處理過的樹脂放入錐形瓶中，分別加入40μg/mL的上樣液（準噶爾山楂多糖溶液）30 mL，恒溫25℃，振蕩吸附24 h后分離出樹脂，加入洗脫液（NaCl溶液）振蕩洗脫24 h，用紫外分光光度計測定溶液的吸光度，根據式（1）、（2）計算不同型號樹脂的吸附率和洗脫率。

式（1）、（2）中：V1為吸附液體積/mL；V2為洗脫液用量/mL；ρ0為上樣液起始質量濃度/（μg/mL）；ρ1為吸附后上樣液質量濃度/（μg/mL）；ρ2為洗脫液質量濃度/（μg/mL）。

根據文獻[19]，將上述方法選出的吸附率和洗脫率最高的兩種樹脂按照不同比例混合，準確稱取5.0 g預處理過的混合樹脂放入錐形瓶中，量取40μg/mL的準噶爾山楂多糖溶液30 mL進行吸附和洗脫，計算吸附率和洗脫率，選出最優的混合比例。

1.3.4多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法[20]。制作標準曲線：精確量取質量濃度為100μg/mL的葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL具塞比色管中，各用蒸餾水補至1.0 mL，使用苯酚-硫酸法顯色，于490 nm波長處測吸光度，橫坐標X為葡萄糖質量濃度（μg/mL），縱坐標Y為吸光度，得到回歸方程：Y=0.069 45X+0.002 8（R2=0.999 14），線性關系良好。

樣品多糖含量的測定：精確稱量70 mg干燥準噶爾山楂粗多糖定容至100 mL，苯酚-硫酸法顯色后測定吸光度，根據標準曲線方程計算得準噶爾山楂多糖質量濃度，按照式（3）計算多糖含量。

式中：ρ為液體中多糖質量濃度/（μg/mL)；V為液體體積/mL；m為稱取干燥樣品的質量/mg。

1.3.5吸附多糖單因素試驗

配制pH值分別為6、7、8、9、10，質量濃度為1 g/L的準噶爾山楂多糖溶液，控制流速3 mL/min，流經樹脂徑高比為1∶10的大孔樹脂柱；配制質量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的準噶爾山楂多糖溶液，固定pH 8，控制流速3 mL/min，流經樹脂徑高比為1∶10的大孔樹脂柱；配制質量濃度為0.5 g/L的準噶爾山楂多糖溶液，固定pH 8，控制流速分別為1.0、3.0、5.0、7.0 mL/min，流經樹脂徑高比為1∶10的大孔樹脂柱；配制質量濃度為0.5 g/L的準噶爾山楂多糖溶液，固定pH 8，流速為1.0 mL/min，流經樹脂徑高比分別為1∶5、1∶8、1∶10、1∶13、1∶15的大孔樹脂柱；收集流出液，計算吸附率。

1.3.6洗脫多糖單因素試驗

配制pH值分別為6、7、8、9、10，濃度為0.2 mol/L NaCl溶液，固定洗脫液用量4 BV，控制流速3.0 mL/min進行洗脫；配制pH 8、洗脫液用量4 BV、濃度為0.2 mol/L的NaCl溶液，控制流速分別為1.0、3.0、5.0、7.0 mL/min進行洗脫；配制pH 8、洗脫液用量4 BV、濃度分別為0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L的NaCl溶液，控制流速1.0 mL/min進行洗脫；配制pH 8、濃度0.25 mol/L的NaCl溶液，控制流速1.0 mL/min，洗脫液用量分別為2、4、6、8BV進行洗脫；收集洗脫液，計算洗脫率。

1.3.7 吸附和洗脫多糖的響應面試驗

選取3 個對吸附率和洗脫率影響較大的單因素，設計Box-Behnken試驗[21-23]，響應面試驗因素與水平見表1、2。

表1 吸附多糖響應面因素水平表Table 1 Factors and their coded levels of response surface design for the optimization of adsorption conditions

表2 洗脫多糖響應面因素水平表Table 2 Factors and their coded levels of response surface design for the optimization of desorption conditions

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

圖1 不同樹脂對多糖的吸附和解吸附能力Fig.1 Comparison of polysaccharide adsorption and desorption capacities of different resins

由圖1可以看出，不同型號樹脂對多糖的吸附能力差異較大，利用吸附的可逆性分離多糖，吸附率與洗脫率的高低都將影響多糖純化的程度，由于樹脂極性不同，吸附洗脫準噶爾山楂多糖的程度也不同，其中以NKA-9的吸附能力最強，D101洗脫率最高，本實驗將采用NKA-9樹脂和D101樹脂按一定比例混合純化準噶爾山楂粗多糖，旨在提高吸附率與洗脫率。

由圖2可以看出，經過混合后的樹脂，吸附率與洗脫率都大幅上升，NKA-9與D101樹脂質量比為2∶3時，吸附率為77%，洗脫率為97%；樹脂質量比為3∶2時吸附率為78%，洗脫率為74%；樹脂質量比為1∶1時， 吸附率為74%，洗脫率為85%。因此選擇NKA-9與D101樹脂比例為2∶3。

圖2 不同混合比例樹脂的吸附率與洗脫率對比Fig.2 Comparison of adsorption and desorption capacities of NKA-9:D101 mixtures in different proportions

2.2 動態吸附準噶爾山楂多糖單因素試驗結果

2.2.1 上樣液pH值對吸附率的影響

圖3 上樣液pH值對吸附率的影響Fig.3 Effect of sample pH on the adsorption rate of polysaccharides

由圖3可以看出，混合樹脂吸附率隨著pH值的升高呈現先升高后下降的趨勢，pH達到8時，吸附率最大。這是因為多糖類物質在強堿性條件下會發生異構化和分解反應，因此在弱堿性條件下有利于大孔樹脂吸附多糖，pH值繼續升高不利于吸附[24-25]，因此選擇pH 8為最佳上樣液pH值。

2.2.2 上樣液質量濃度對吸附率的影響

圖4 上樣液質量濃度對吸附率影響Fig.4 Effect of sample concentration on the adsorption rate of polysaccharides

由圖4可以看出，隨著上樣液質量濃度從0.5 g/L逐漸增加，吸附率反而下降，這是因為樹脂吸附目標產物時，存在著一個吸附平衡，該平衡和料液質量濃度有很大的關系。尤其是當樹脂的吸附平衡是受液膜擴散控制時，料液質量濃度對樹脂吸附平衡影響更大[26]，當上樣液質量濃度過大時，多糖含量高，過于密集，不能使其更充分地與樹脂接觸，影響吸附效果，且高質量濃度會增加懸浮雜質，堵塞樹脂孔洞，所以選擇0.5 g/L為上樣液合適質量濃度。

2.2.3 上樣液流速對吸附率的影響

圖5 上樣液流速對吸附率的影響Fig.5 Effect of sampling flow rate on the adsorption rate of polysaccharides

由圖5可知，隨著上樣液流速的增加，吸附率在不斷降低，上樣液流速為1.0 mL/min時，混合樹脂的吸附率最大。這是由于流速的增加意味著多糖的單位時間流量增加，過快的流速會提 前泄漏，不能使樹脂充分吸附多糖，降低內孔利用率，引起損失，流速低，有利于充分吸附，但會影響生產效率，使生產周期延長，所以確定1.0 mL/min為上樣液最佳流速。

2.2.4 樹脂徑高比對吸附率的影響

圖6 樹脂徑高比對吸附率的影響Fig.6 Effect of column diameter-to-height ratio on the adsorption rate of polysaccharides

由圖6可知，大孔樹脂徑高比和吸附率呈良好的線性關系，隨著樹脂徑高比的減小，吸附率不斷增大。因為樹脂用量越大，吸附總表面就越大，越有利于吸附過程的進行，但樹脂用量過多，又將導致成本增加。從節省材料和最適吸附率角度考慮，確定1∶13為合適大孔樹脂徑高比。

2.3 動態洗脫準噶爾山楂多糖單因素試驗結果

2.3.1 洗脫液pH值對洗脫率的影響

由圖7可以看出，隨著洗脫液pH值的升高，洗脫率也隨之增高，pH 8時洗脫率最高，pH 9時，洗脫率開始有所降低，pH值升高到10時，洗脫率急速下降，這是由于過堿性的條件會引起 多糖降解且不符合樹脂本身性質要求，因此選擇pH 8為洗脫液的最佳pH值。

圖7 洗脫液pH值對洗脫率的影響Fig.7 Influence of eluent pH values on the elution efficiency

2.3.2 洗脫液流速對洗脫率的影響

圖8 洗脫液流速對洗脫率的影響Fig.8 Effect of eluent flow rate on the desorption rate of polysaccharides

由圖8可以看出，洗脫液流速與洗脫率成反比例關系，隨著流速的增大，洗脫率在不斷降低，洗脫液流速為1.0 mL/min時，多糖的洗脫率最高，這是由于過快的流速使洗脫液與樹脂柱接觸不充分，導致多糖洗脫率降低，確定1.0 mL/min為洗脫液的最適流速。

2.3.3 洗脫液濃度對洗脫率的影響

圖9 洗脫液濃度對洗脫率的影響Fig.9 Effect of eluent concentration on the desorption rate of polysaccharides

由圖9可以看出，隨著NaCl溶液濃度的增高，洗脫率先升高后下降，出現這種情況是由于鹽濃度過低會使多糖更易被吸附，吸附后不易被洗脫，鹽濃度過高會使溶液的顆粒物含量增大，降低多糖洗脫率。所以確定0.25 mol/L為洗脫液的最適濃度。

2.3.4 洗脫液用量對洗脫率的影響

圖10 洗脫液用量的選擇Fig.10 Effect of eluent amount on the desorption rate of polysaccharides

由圖10可以看出，洗脫劑用量與洗脫率呈正相關，隨著NaCl溶液用量的增加，洗脫率在不斷上升，用量越大，洗脫率越大，但增加幅度不斷減小，在6～8 BV之間增加幅度最小。從節省洗脫劑的用量的角度考慮，選用6 BV的NaCl溶液洗脫。

2.4 響應面試驗結果

表3 吸附多糖響應面試驗設計與結果Table 3 Response surface design arrangement and corresponding experimental data for the optimization of adsorption conditions

使用Design-Expert軟件，得到響應面試驗設計與結果見表3、4。對結果進行分析擬合，得到二次多元回歸方程：

吸附率（Y1）對上樣液流速（A）、上樣液質量濃度（B）、樹脂徑高比（C）的回歸方程：

洗脫率（Y2）對洗脫液濃度（X1）、洗脫液流速（X2）、洗脫液用量（X3）的回歸方程：

表4 洗脫多糖響應面試驗設計與結果Table 4 Response surface design arrangement and corresponding experimental data for the optimization of desorption conditions

對得到的吸附與洗脫回歸模型分別進行方差分析如表5、6所示。

表5 吸附率回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted regression equation for the adsorption rate of polysaccharides

吸附模型極顯著（P＜0.001），失擬項（P=0.918 2＞0.05）不顯著，說明模型與試驗擬合程度較高，可用于上樣液流速（A）、上樣液質量濃度（B）、樹脂徑高比（C）對樹脂吸附率的理論預測。回歸方程各項顯著性表明：一次項A（P=0.001 9＜0.01）顯著，B（P=0.001）極顯著，C（P=0.004 1＜0.01）顯著，交互項只有BC項有差異，平方項A2為極顯著項，C2為顯著項，根據回歸方程一次項系數絕對值大小可以得到，在試驗范圍內，3 個因素對多糖吸附率的影響由大到小排序為：上樣液質量濃度（B）＞上樣液流速（A）＞樹脂徑高比（C）。

表6 洗脫率回歸模型的方差分析Table 6 Analysis of variance for the fitted regression equation for the desorption rate of polysaccharides

洗脫模型極顯著（P＜0.0 0 0 1），失擬項（P=0.385 2＞0.05）不顯著，說明模型與試驗擬合程度較高，可用于洗脫液濃度（X1）、洗脫液流速（X2）、洗脫液用量（X3）對多糖洗脫率的理論預測?；貧w方程各項顯著性表明：一次項X1（P＜0.000 1）極顯著，X2、X3都為顯著項，平方項都為極顯著項，為顯著項，說明選取的三因素對NaCl溶液洗脫準噶爾山楂多糖的影響不是簡單的線性關系，平方項對響應值也有很大影響。根據回歸方程一次項系數絕對值大小可以得到，在試驗范圍內，3 個因素對多糖洗脫率的影響由大到小排序為：洗脫液濃度（X1）＞洗脫液用量（X3）＞洗脫液流速（X2）。

2.5 響應面分析

2.5.1 動態吸附多糖各因素間交互作用的響應面

圖11 動態吸附多糖各因素間相互影響的響應面圖Fig.11 Response surface plots illustrating the effect of adsorption parameters on the adsorption rate of polysaccharides

由圖11a可見，等高線圖呈橢圓形，說明上樣液流速和質量濃度的交互作用對多糖吸附率影響顯著，當流速相同時，隨著上樣液質量濃度的增大，吸附率變化不顯著；當上樣液質量濃度一定時，隨著流速的增加，吸附率也增加，當流速超過一定范圍時，反而不利于吸附。由圖11b可見，等高線圖呈圓形，響應面圖的坡度較為平緩，說明樹脂徑高比和流速的交互作用對多糖吸附率影響不顯著，當樹脂徑高比相同時，隨著流速的增大，吸附率增大；當流速相同時，隨著樹脂徑高比的 減小，吸附率增大。由圖11c可見，等高線圖呈橢圓形，說明樹脂徑高比和上樣液質量濃度的交互作用對多糖吸附率影響顯著；當樹脂徑高比相同時，隨著上樣液質量濃度的增加，吸附率變化不明顯；當上樣液質量濃度一定時，隨著樹脂徑高比的減小，吸附率先升高后降低。

通過對方程求解得到最佳吸附條件為上樣液流速3.75 mL/min、上樣液質量濃度1.32 g/L、樹脂徑高比1∶13.2，吸附率為62.77%。考慮到實際操作的便利，將其修正為上樣液流速3.75 mL/min、質量濃度1.32 g/L、樹脂徑高比1∶13，根據此條件進行吸附驗證實驗，吸附率為60.75%。

2.5.2 動態洗脫多糖各因素間交互作用響應面

圖12 動態洗脫多糖各因素間交互作用的等高線及響應面圖Fig.12 Response surface and contour graphs illustrating the effect of desorption parameters on the desorption rate of polysaccharides

由圖12a可見，等高線圖呈圓形，響應面圖的坡度較為平緩，說明洗脫液流速和濃度的交互作用對多糖洗脫率影響不顯著，當流速相同時，隨著濃度的增大，洗脫率升高；當濃度一定時，隨著流速的增加，洗脫率變化不明顯。由圖12b可見，等高線圖呈橢圓形，響應面圖的坡度較陡，說明洗脫液濃度和用量的交互作用對多糖洗脫率影響顯著，當濃度相同時，隨著用量的增大，洗脫率變化不明顯；當用量相同時，隨著濃度的增大，洗脫率先增大后減小。由圖12c可見，等高線圖呈橢圓形，說明用量和流速的交互作用對多糖洗脫率影響顯著；當用量相同時，隨著流速的增加，洗脫率變化不明顯；當流速一定時，隨著用量的增大，洗脫率先升高后降低。

對方程求解，得到最佳洗脫條件為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.44 mL/min、洗脫液用量6.73 BV，洗脫率89.97%，考慮到實際操作的便利將其修正為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.5 mL/min、洗脫液用量7 BV，根據此條件進行洗脫驗證實驗，洗脫率為84.22%，與預測值相差不大，實驗結果表明，經過純化后，樣品多糖含量由原來的5.06%上升至21.13%，可見采用響應面法可實現多條件同步優化準噶爾山楂精制工藝，具有實際應用價值。

3 結 論

在比較D101、NKC-9、NKA-9、YPR-Ⅱ、S-8、CAD-40和HPD100樹脂對準噶爾山楂多糖溶液吸附和洗脫效果基礎上選擇NKA-9和D101為最優樹脂。NKA-9與D101樹脂質量比為2∶3對準噶爾山楂多糖的吸附洗脫效果最好。最佳吸附工藝條件為上樣液流速3.75 mL/min、質量濃度1.32 g/L、樹脂徑高比1∶13，此條件下多糖的吸附率為60.75%。最佳洗脫工藝條件為洗脫液濃度0.27 mol/L、洗脫液流速3.5 mL/min、洗脫液用量7 BV，此條件下多糖的洗脫率為84.22%。

與常規方法相比，采用混合大孔樹脂純化多糖，多糖的損失率較小，能夠較大地提高多糖的得率。經過純化后，樣品多糖含量由原來的5.06%上升至21.13%，提高近4 倍，本研究為準噶爾山楂殘渣多糖的純化提供新方法，具有較好的應用價值。

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Optimization of Purification Process for Crude Polysaccharides from the Pomace of Wild Crataegus songorica in Xinjiang by Response Surface Methodology

ZHANG Yu, LI Jin*, L? Haiying, ZHANG Xia, ZHANG Huali
(Xinjiang Key Laboratory of Special Sp ecies Conservation and Regulatory Biology, College of L ife Sciences, Xinjiang Normal University, ?rümqi 830054, China)

In order to improve the purity of polysaccharides from the pomace of wild Crataegus songorica, NKA-9 and D101 were selected from 7 kinds of macroporous resins by static adsorption-desorption experiments, and the two selected resins were mixed at an appropriate ratio. On the basis of single factor expe riments, response surface methodology was used to optimize process parameters. The optimal mixing ratio of NKA-9 to D101-1 was 2:3 (by mass). The optimum experimental parameters for adsorption were as follows: sample loading fl ow rate, 3.75 mL/min; sample concentration, 1.32 g/L; and resin diameter-to-height ratio, 1:13, yielding a rate of adsorption of 60.75%. Under the optimal desorption conditions: 7 BV of 0.27 mol/L NaCl as eluent at a fl ow rate of 3.5 mL/min, a rate of desorption of 84.22% could be achieved. The content of polysaccharides was increased from 5.06% to 21.13%.

Crataegus songorica; polys accharides; response surface methodology; purifi cation

Q946.8

A

1002-6630（2015）12-0022-07

10.7506/spkx1002-6630-201512005

2014-11-22

國家自然科學基金青年科學基金項目（31200300）；新疆維吾爾自治區教育廳重點實驗室項目（XJSD2013-0104）

張玉（1990—），女，碩士研究生，主要從事植物資源研究。E-mail：1107662720@qq.com

*通信作者：李進（1969—），男，教授，博士，主要從事植物生理生態和資源利用研究。E-mail：xjcjlj4@xjnu.edu.cn