傳統酸面團中植物乳桿菌發酵饅頭抗氧化特性及揮發性風味物質特征

程曉燕，孫銀鳳，劉 娜，黃衛寧,*，李 寧，FILIP Arnaut

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.廣州焙樂道食品有限公司，廣東 廣州 511400；3.焙樂道食品集團，比利時 布魯塞爾 1210）

CHENG Xiaoyan1, SUN Yinfeng1, LIU Na1, HUANG Weining1,*, LI Ning2, FILIP Arnaut3(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Guangzhou Puratos Food Co. Ltd., Guangzhou 511400, China; 3. Putatos Group NV/SA, Brussels 1210, Belgium)

傳統酸面團中植物乳桿菌發酵饅頭抗氧化特性及揮發性風味物質特征

程曉燕1，孫銀鳳1，劉 娜1，黃衛寧1,*，李 寧2，FILIP Arnaut3

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.廣州焙樂道食品有限公司，廣東 廣州 511400；3.焙樂道食品集團，比利時 布魯塞爾 1210）

以普通小麥饅頭（記為WS）和植物乳桿菌標準菌株發酵饅頭（記為LPS）為對照，通過測定總酚含量和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，同時采用固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術，研究傳統酸面團中植物乳桿菌植物亞種發酵饅頭（記為ZLPS）的抗氧化特性及揮發性風味物質特征。結果表明：乳酸菌發酵，尤其是植物乳桿菌植物亞種的發酵可以明顯改善蒸制帶來的饅頭抗氧化特性降低，與WS相比，ZLPS中總酚含量增加了108.70%，DPPH自由基清除能力為WS的13.65倍；乳酸菌發酵酸面團使得饅頭的揮發性風味物質含量增高，酸面團發酵饅頭的揮發性風味物質總含量分別增加了53.11%（LPS）、56.92%（ZLPS），且ZLPS還產生了一些獨特的揮發性風味物質，如乙酸異戊酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-辛醇、2-乙基己醇、乙酸-2-苯乙基酯等；ZLPS各項指標評分均較高，更具有獲得消費者青睞的潛力。

傳統酸面團；饅頭；抗氧化特性；氣相色譜-質譜法；主成分分析

饅頭是我國人民的傳統主食之一，具有鮮明的民族特色，其歷史可追溯至春秋戰國時期[1]，經過多年的傳承、演化形成了今日豐富的品種樣式[2]。如今，饅頭按其所用發酵劑不同主要分為2種類型[3-4]，一種是采用商業酵母進行發酵的饅頭，一種是采用傳統酸面團作為發酵劑制作而成的饅頭。商業酵母饅頭的風味單一，且營養及口感都相對較差；而酸面團中乳酸菌的發酵不僅可以改善饅頭的比容、質構并延長饅頭貨架期，還可以改善饅頭的風味和營養價值。

近年來酸面團技術研究是烘焙食品領域的熱門研究課題[5]。學者們[6-10]分別研究了不同發酵基質的乳酸菌發酵酸面團的理化性質及其對面包體系的風味、流變發酵學及其烘焙學特性的影響。我國關于酸面團發酵饅頭的研究剛剛起步[11-14]，Kim[11]、Wu Chao[12]、劉娜[14]等研究了酸面團發酵制作饅頭的自然發酵過程并分析傳統酸面團饅頭風味及加堿與否對饅頭理化性質及風味的影響。酸面團是一個極其復雜的生態系統，而乳酸菌則是其中的優勢微生物群落[15]。植物乳桿菌是發酵酸面團的最主要菌種之一[16]，但利用從我國傳統酸面團中提取分離出來的具有當地特色的乳酸菌，尤其是植物乳桿菌發酵酸面團并制作饅頭的研究還未見報道。

本研究旨在研究利用具有地域性特色的乳酸菌發酵酸面團并制作饅頭的優勢，通過測定總酚含量（total phenolic content，TPC）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力，并采用固相微萃取（solid phase mictroextraction，SPME）和氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用[14]的技術，探討傳統酸面團中提取出來的植物乳桿菌植物亞種發酵對酸面團、饅頭抗氧化特性的影響，填補利用具有當地特色的乳酸菌發酵酸面團相關研究的空白，為開發營養健康、風味獨特的饅頭的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

小麥粉 丹陽同樂面粉有限公司；即發性活性干酵母 廣東梅山馬利酵母有限公司；植物乳桿菌標準菌株Biogreen300（記為LP） 丹尼斯克（中國）有限公司；MRS肉湯培養基 杭州百思生物技術有限公司；植物乳桿菌植物亞種（記為ZLP）分離自河南駐馬店傳統酸面團。

1.2儀器與設備

SM-25攪拌機、SPC-40SP醒發箱 無錫新麥機械有限公司；57330-U固相微萃取裝置及75μm碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（carboxen/polydimethylsiloxane，CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司；Trance GC-MS聯用儀 美國Finnigan公司；THB-402型超凈工作臺無錫一凈凈化儀器設備廠；APX-150C型恒溫恒濕培養箱上海博訊實業集團有限公司；LPZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠。

1.3方法

1.3.1乳酸菌發酵酸面團的制備

將LP和ZLP接入MRS肉湯培養基，2次活化后培養至對數生長期后期，4 000 r/min離心20 min，用生理鹽水洗滌2次，得到菌泥。按m（小麥粉）∶m（水）= 1∶1，加入質量分數0.25%上述菌泥，混合均勻，于醒發箱（37℃，相對濕度85%）中培養，至其pH值降為4.0時即可。

1.3.2饅頭的制備

普通小麥粉饅頭（記為WS）、植物乳桿菌標準菌株發酵饅頭（記為LPS）和駐馬店植物乳桿菌植物亞種發酵饅頭（記為ZLPS）的制作配方見表1，添加量按照面粉質量分數計算。其制作工藝為：將即發性活性干酵母溶解在水中，稱取小麥粉投入攪面缸，倒入上述溶解了酵母的水溶液和乳酸菌酸面團，先慢攪5 min，再快攪2 min后取出，于室溫靜置10 min，然后用壓面機壓面10次（其厚度參數為7 mm）得到饅頭面團。將上述面團分割成70 g/塊，手工揉圓，于醒發箱（38℃，相對濕度85%）中醒發60 min，沸水入鍋，蒸制20 min，熄火后冷卻3 min取出，并于室溫冷卻30 min得到饅頭。

表1 不同饅頭樣品配方Table 1 Formulations of steamed breads

1.3.3饅頭抗氧化特性的測定

樣品提取液制備：參照Lin Liyun等[17]的提取方法并做了改進。取經過真空冷凍干燥粉碎的樣品10 g，加入100 mL體積分數80%甲醇溶液，于37℃，120 r/min振蕩水浴鍋中提取2 h，3 000 r/min離心15 min，取其上清液。下濁液重復上述操作，再次取上清液，2次得到的上清液混勻后得到提取液。

TPC測定：采用分光光度計法測定，參照Singleton等[18]的方法并做改進。以沒食子酸作為參考標準，將100μL提取液、5.9 mL體積分數80%甲醇溶液、1 mL福林酚溶液和3 mL質量分數20%碳酸鈉溶液加入到10 mL容量瓶中，充分混勻后于室溫放置2 h，在波長765 nm處測定吸光度。TPC以沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）表示，即mg GAE/100 g干物質量。重復實驗3次。

DPPH自由基清除能力測定：參照劉彥[19]的方法并做改進。取100μL樣品提取液，加入3.9 mL 0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液，混合均勻，于室溫條件下避光反應30 min，在波長517 nm處測其吸光度。使用100μL體積分數80%甲醇溶液代替樣品作為空白對照。DPPH自由基清除能力結果表示為水溶性VE當量（trolox equivalent anti-oxidant capacity，TEAC），即mg TEAC/100 g干物質。重復實驗3次。

1.3.4 SPME-GC-MS分析饅頭中揮發性風味物質

1.3.4.1揮發性成分的頂空-SPME

將制作好的饅頭芯分割成約長寬為5 mm×5 mm，高為3 mm的碎片，稱取5.0 g放入SPME樣品瓶中，蓋上瓶蓋，把樣品瓶置于60℃恒溫水浴中，并將已老化好的萃取頭插入到樣品瓶的上空，頂空萃取40 min，然后使纖維頭退回到針頭內，拔出萃取頭進樣。

1.3.4.2 GC-MS分析

G C條件：D B-5 M S毛細管色譜柱（6 0 m×0.32 mm，1μm）；升溫程序：起始溫度40℃，保留1 min，然后以6℃/min升溫至160℃，接著以10℃/min升溫至250℃，保留10 min[14]。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；進樣孔溫度250℃；發射電流200μA；離子源溫度200℃；采集方式設定為全掃描；質量掃描范圍m/z33～495[14]。

1.3.4.3揮發性風味物質定性定量分析

對GC-MS圖譜進行計算機分析和人工檢索，把每個峰同時與NIST Library和Wiley Library相匹配檢索定性，參考匹配度、純度及相關文獻作為鑒定的依據。化合物定量：采用峰面積歸一化法計算相對含量。

1.3.5饅頭感官評定

感官評定小組由30位經過培訓的人員（15名女性，15名男性）組成。評定方法采用9分嗜好評分法[20]，對饅頭的外觀、色澤、風味、口感、內部結構以及整體可接受度進行評分。其中1～9分別代表極度不喜歡、非常不喜歡、正常不喜歡、略微不喜歡、不喜歡也不討厭、略微喜歡、正常喜歡、非常喜歡以及極度喜歡。

1.4數據分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0對數據進行計算、顯著性分析及主成分分析（principal component analysis，PCA），其中顯著性差異水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1不同饅頭的抗氧化特性分析

圖1 酸面團中乳酸菌發酵對小麥面團和饅頭抗氧化特性影響Fig.1 Effect of LAB fermentation on antioxidant properties of wheat dough and steamed breads

小麥粉中抗氧化物質含量極少[19]，而發酵可以提高谷物的生物活性[21]，但同時蒸制會對其抗氧化特性產生較大影響，這可能與抗氧化物質大多都具有熱不穩定的性質有關[22]。由圖1可以看出，蒸制后得到的饅頭抗氧化特性顯著下降，而乳酸菌發酵酸面團的引入則可以明顯改善這種蒸制帶來的品質劣化，與Lindenmeier等[22]的研究結果一致，這可能是由于酸面團中的乳酸菌可以水解谷物中的蛋白以釋放具有抗氧化特性的活性肽[23]，使得制品的抗氧化特性有顯著提高[17,24]。同時，由圖1可以看出，相較于WS，ZLPS的TPC增加了108.70%，而LPS的TPC增加了86.54%；其DPPH自由基清除能力則為WS的13.65倍，較之LPS（6.36倍）高出1.89倍，因此ZLPS的改善作用較LPS更為顯著。

2.2不同饅頭揮發性風味物質分析

微生物（主要包括乳酸菌及酵母菌）發酵作用于面粉基質會產生一系列產物，其中酸、醇、酯、醛、酮等化合物是饅頭風味的主要來源[12,14]。由圖2可以看出，WS譜圖與LPS、ZLPS譜圖都有很大不同，這與楊秀琴等[25]的研究結果一致。由表2可知，所有饅頭樣品中共檢測出60種揮發性風味物質，其中，WS中檢測出40種揮發性風味物質，LPS和ZLPS中均檢測出42種揮發性風味物質，不同饅頭中揮發性風味物質種類數量差別不大，但是相較于WS，LPS以及ZLPS揮發性風味物質總量分別增加了53.11%和56.92%。

所有樣品中乙醇相對含量最高，這與蘇東海等[28]研究一致。3-甲基丁醇次之，3-甲基丁醇具有水果香和花香味[26]，其次，在3個樣品中相對含量較高的物質分別為苯乙醇和乙酸乙酯，前者具有玫瑰花香味，后者具有蘋果香和香蕉香味[27]，是饅頭的重要呈香物質[14]，經過乳酸菌發酵后，這些揮發性風味物質的相對含量均顯著增加，且ZLPS的增幅更加明顯。由表3可以看出，醇類、酸類及酯類相對含量較高，是饅頭的主要揮發性風味物質。雖然芳香雜環類物質相對含量也較多，且具有豐富的果香味和花香味，但其閾值較高[27]，對饅頭風味的共貢獻不大。經過酸面團發酵的饅頭中，醇類及酸類物質相對含量增加，相應的酯類物質（具有蘋果香和奶香[27]）相對含量也顯著增加，這可能是由于蒸制過程中醇類和酸類發生了酯化反應的結果[28]。酮類物質相對含量升高，而醛類物質相對含量變化不大，烷烯烴類物質相對含量顯著下降，而烷烯烴類物質閾值較大，基本不具有風味活性[29-30]。由表2還可以看出，經過ZLP發酵制成的饅頭還產生了一些特有的揮發性風味物質，如乙酸異戊酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-辛醇、2-乙基己醇、乙酸-2-苯乙基酯等。這些物質也是首次在饅頭揮發性風味物質中發現，其中，乙酸異戊酯呈香蕉香和甜香味；6-甲基-5-庚烯-2-酮又名甲基庚烯酮，具有檸檬草香氣，是香精香料合成的重要中間體[31]。這些風味物質的產生可能是乳酸菌與酵母菌協同作用發酵過程中產生的代謝產物之間發生相互作用，生成了一系列次級代謝產物所致[32-33]。

圖2 不同饅頭揮發性風味物質的GC-MS圖Fig.2 GC-MS chromatograms of volatile compounds of different steamed breads

表2 不同饅頭揮發性風味物質分析結果Table 2 Composition of volatile flavor compounds in different steamed breads

續表2

表3 不同饅頭揮發性風味物質類別統計分析結果Table 3 Analysis results of volatile flavor compounds in different steamed breads

圖3 不同饅頭揮發性風味物質（a）和標準風味物質（b）的PCAFig.3 PCA of volatile flavor compounds of different steamed breads

對不同饅頭樣品中的揮發性風味物質做PCA，分析結果見圖3。由圖3a可以看出，WS的揮發性風味物質與LPS、ZLPS差異較大，而LPS和ZLPS之間的揮發性風味物質構成較為接近，此結果與各個樣品的色譜圖所顯示的結果一致。將樣品中的揮發性風味物質進行分類，分別為醇類、酸類、酯類、醛類、酮類、芳香雜環類和烷烯烴類7類，并對其進行PCA，分析結果見圖3b。WS和LPS、ZLPS之間的差異主要體現在芳香雜環類和酸類、醇類、酯類的相對含量不同，芳香雜環類物質對WS的風味貢獻較大，芳香族類化合物與酯類化合物一樣，通常具有花香和水果香氣，但芳香族類化合物閾值一般較大[27]，不利于形成濃郁的風味。結合圖3a和圖3b，LPS、ZLPS的揮發性風味物質主要分布在醇類、酸類和酯類3類化合物之中，且由于大部分醇類、酸類和酯類的閾值較低[27]，因此LPS和ZLPS風味較WS更為豐富、濃郁。

2.3饅頭感官特性分析

圖4 不同饅頭的感官評定雷達圖Fig.4 Sensory characteristics of different steamed breads

如圖4所示，相較WS，酸面團發酵的饅頭在外觀、內部結構、口感、風味及整體接受度均有明顯提高。這與Poutanen等[34]的結論一致，酸面團的添加可以改善制品的風味、質構及穩定性。這是由于乳酸菌發酵的中間產物可以促進酵母菌的生長，進而使得發酵后的饅頭具有更加飽滿的外觀、綿密均勻的氣孔結構，并且使其內部結構細膩富有彈性，獲得較佳的口感；同時乳酸菌與酵母菌協同發酵可以產生更為獨特的風味物質，獲得濃郁誘人的饅頭香味。因而從整體可接受度角度來看，LPS和ZLPS優于WS，更能贏得消費者的青睞。

3 結 論

乳酸菌發酵顯著提高了小麥面團的抗氧化活性物質的含量，其中，ZLPD的TPC比WD增加了38.27%，比LPD增加了8.7%，且其DPPH自由基清除能力為WD的13.5倍，與LPD相比增加顯著，因而酸面團發酵顯著提高了面團的抗氧化特性，且ZLPD的抗氧化特性的增幅更為顯著，雖然蒸制后饅頭的抗氧化特性下降，但乳酸菌（尤其是分離自傳統酸面團的ZLP）發酵酸面團的引入可以明顯地改善蒸制帶來的品質劣化，與WS相比，ZLPS的TPC增加了108.70%，DPPH自由基清除能力為WS的13.65倍，與LPS相比，ZLPS的TPC和DPPH自由基清除能力均顯著增加。

乳酸菌發酵酸面團的引入增強了饅頭的風味，LPS和ZLPS中揮發性風味物質總相對含量分別增加了53.11%、56.92%，且對饅頭風味貢獻不大的烷烯烴類顯著下降，其中，ZLP發酵酸面團制作而成的饅頭中風味物質總相對含量最高，且產生了一些獨特的揮發性風味物質，如乙酸異戊酯、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-辛醇、2-乙基己醇、乙酸-2-苯乙基酯等。PCA結果顯示，酸面團發酵饅頭中閾值較低的醇類、酸類和酯類更是起到主導作用。

酸面團發酵饅頭的感官評分明顯高于WS。相較普通小麥饅頭，酸面團發酵饅頭在外觀、內部結構、口感、風味及整體接受度均有明顯提高。且ZLPS的感官評分在各方面均略優于LPS，更具有獲得消費者青睞的潛力。

ZLP酸面團發酵饅頭無論是在抗氧化特性和風味物質方面均明顯優于LPS，這說明從傳統酸面團中提取分離出來的具有地域特色的乳酸菌在饅頭的生產方面比標準菌株更具有應用潛力。因而，本研究為具有鮮明的中國地域性特色的乳酸菌在酸面團發酵技術乃至現代發酵面食品工業化進程中的應用提供一定理論參考。

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Antioxidant Properties and Flavor Characteristics of Steamed Bread Fermented byLactobacillus plantarumIsolated from Traditional Sourdough

In this study, steamed bread (ZLPS) fermented byLactobacillus plantarumsubsp.plantarumisolated from traditional sourdough were studied for their antioxidant property and flavor characteristics. Common wheat steamed bread (WS) and steamed bread (LPS) fermented byLactobacillus plantarumBiogreen 300were used as controls. The antioxidant properties of the three samples were evaluated by total phenolic content (TPC) and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging ability while the flavor characteristics were determined using solid phase mictroextraction-gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS). The results showed that fermentation byLactobacillus plantarumsubsp.plantarumisolated from traditionalsourdough was able to significantly inhibit the decrease of antioxidant properties of steamed bread samples caused by steaming. Compared to WS, the TPC of steamed bread fermented byLactobacillus plantarumsubsp.plantarumwas increased by 108.70%, while its DPPH radical-scavenging capacity was 13.65 times higher than that of WS. The total content of volatile flavor compounds was increased by 53.11%for LPS and 56.92%for ZLPS, respectively, suggesting enhanced flavor of the steamed breads. ZLPS also produced a number of unique flavor substances such as iso-amyl acetate, 6-methyl-5-heptene-2-one, 3-octanol, 2-ethyl-1-hexanol, and acetic acid 2-phenylethyl ester. Furthermore ZLPS showed the highest sensory evaluation scores.

traditional sourdough; steamed bread; antioxidant property; gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS); principal component analysis (PCA)

CHENG Xiaoyan1, SUN Yinfeng1, LIU Na1, HUANG Weining1,*, LI Ning2, FILIP Arnaut3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2. Guangzhou Puratos Food Co. Ltd., Guangzhou 511400, China; 3. Putatos Group NV/SA, Brussels 1210, Belgium)

TS202.1

A

1002-6630（2015）12-0087-06

10.7506/spkx1002-6630-201512016

2014-10-27

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2012AA022200）；

江蘇省產學研聯合創新基金——前瞻性聯合研究項目（BY2014023-16）；張家港市科技計劃項目（ZKN1301）；

蘇州市科技支撐計劃項目（SNG201401）；比利時國際合作項目（B17022012）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2012310）

程曉燕（1989—），女，碩士研究生，研究方向為烘焙科學、功能配料與食品添加劑。E-mail：ciyachen@126.com

*通信作者：黃衛寧（1963—），男，教授，博士，研究方向為烘焙科學與發酵技術、谷物食品化學。E-mail：wnhuang@jiangnan.edu.cn