離子色譜法-積分安培檢測器測定葡萄酒中的天然糖

馬甲民，崔 鶴*，張文皓，李 立，董麗臻，李慧新

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266001；2.青島大學，山東 青島 266071；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123）

離子色譜法-積分安培檢測器測定葡萄酒中的天然糖

馬甲民1,2，崔 鶴1,*，張文皓1，李 立3，董麗臻1，李慧新1

（1.山東出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266001；2.青島大學，山東 青島 266071；3.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123）

建立測定葡萄酒中常見的8種天然糖（阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、果糖、L-山梨糖、蔗糖、異麥芽酮糖和麥芽糖）的離子色譜分析方法。以淋洗液發生器電解產生的KOH溶液梯度淋洗，在CarboPac PA20高效陰離子交換柱上，8種天然糖可以在30 min內完成分離。使用積分安培檢測器進行測定，8種糖的檢出限（進樣量10μL，RSN=3）分別為0.007、0.004、0.005、0.005、0.003、0.014、0.016 mg/L和0.020 mg/L，且均具有較寬的線性范圍（0.06～30 mg/L）。樣品測定的相對標準偏差在4.9%～8.7%之間，8種糖的加標回收率在81.5%～95.1%之間；本方法檢測糖簡便快捷、分離效果好、無需衍生、靈敏度高，適用于葡萄酒中的8種常見天然糖組分的分析。

離子色譜；積分安培檢測器；葡萄酒；天然糖

自然界中，天然糖種類繁多，已發現的單糖主要是戊糖和己糖。天然存在的游離態和具有機能的二糖以哺乳類的乳糖、細菌和昆蟲血液等的海藻糖、植物的蔗糖、麥芽糖等為代表。這些是作為各種生物體的能量來源，或者作為生物體組成的物質原料，承擔著所必需的糖類的貯藏或運輸的重要作用。葡萄酒中的糖種類、含量對酒的風味有較大的影響[1]。從葡萄酒行業內的信息看出在釀造過程中加入某些糖類對提高香氣復雜性、濃郁度有很好的幫助[2-3]。根據GB 2760—2011《食品添加劑使用標準》，規定異麥芽酮糖為甜味劑，按生產需要適量使用[4]。對照國外食品添加劑要求，D-木糖、L-阿拉伯糖和L-山梨糖未列入GB 2760—2011，也沒有限量要求[5-6]。因此，對各國進口葡萄酒進行本底調查，測定葡萄酒中天然糖的種類、含量的信息顯得尤為必要。

由于食品基質比較復雜，樣品前處理較為繁瑣，食品中天然糖的測定比較困難[7]。葡萄酒中天然單糖和二糖的測定研究不是很多，目前常見的食品中糖測定方法有化學法（比色法、滴定法）[8-9]、液相色譜串聯光檢測器法[10-11]、離子色譜法[12-13]、液相色譜-質譜聯用法[14-16]、離子色譜-質譜聯用法[17-18]、酶催化-電化學法[19]等。電位滴定法方法簡單、成本較低、操作簡便，可以直接測定出葡萄酒中的還原糖總量，但是不能分別測定出各種糖的含量[9]；液相色譜或離子色譜與質譜聯用對食品中糖的測定具有方法簡便的特點，并且可以同時對糖定性定量分析，但是其前處理較為繁瑣，所用質譜儀器設備成本較高[14-18]；高效液相色譜串聯光檢測器及脈沖安培檢測器是目前最為廣泛的測定食品樣品中糖含量的方法之一，但是其所測定的食品樣品大多為固體樣品，沒有將其應用于葡萄酒中天然糖進行分離分析[20]。

在加氧化還原電壓條件下，糖類分子具有電化學活潑性，且其在強堿溶液中呈離子化狀態[21]。在OH-存在的條件下，它們會部分或全部以陰離子形式存在，可以在陰離子交換色譜柱上被分離。離子色譜法檢測糖主要使用金電極的安培檢測器。當在金電極上施加電壓，糖易在金電極表面發生氧化反應；在堿性條件下，金電極催化活性非常高；而且糖的檢測過程中不需衍生反應和復雜的樣品純化處理。

本研究利用石墨化炭黑做填料的固相萃取（solid phase extraction，SPE）柱對葡萄酒樣品進行處理，通過陰離子交換色譜法同時對進口葡萄酒中的8種天然糖進行分離，并通過積分安培檢測器對8種糖進行檢測，建立一種葡萄酒樣品中糖的離子色譜分析方法。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

葡萄酒樣品 市售進口葡萄酒。實驗所有用水均為經Milli-Q去離子水制備裝置制備的電導率不小于18.2 MΩ·cm的去離子水；葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、L-山梨糖、蔗糖、麥芽糖、異麥芽酮糖（帕拉金糖）標準品 德國Dr.Ehrenstorfer公司，購自上海悌希愛試劑公司；甲醇（色譜純） 德國Merck公司；石墨化炭黑及C18填料 美國Agilent公司。

1.2儀器與設備

ICS5000+離子色譜儀（帶有DP-5四元梯度泵、AS-AP自動進樣器、在線淋洗液KOH發生裝置EGC500+、積分安培電化學檢測器及Chromeleon數據處理系統）、Dionex CarboPac PA20色譜柱美國Thermo公司；Milli-Q去離子水制備裝置。

1.3方法

1.3.1色譜條件

淋洗液：KOH溶液；色譜柱：Dionex CarboPac PA20；柱溫：30℃；檢測器：積分安培檢測器；工作電極：Au電極；參比電極：Ag/AgCl電極；梯度洗脫條件見表1，檢測器檢測波形見表2。

表1 KOH溶液梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

表2 糖測定的積分安培檢測波形Table 2 Integrated pulsed amperometric detection waveforms for sugars

1.3.2 樣品前處理

依次使用3 mL去離子水、1 mL甲醇分別活化石墨化炭黑SPE柱，取葡萄酒樣品2.0 mL稀釋5倍后，取5.0 mL經SPE柱及0.22μm濾膜過濾，收集濾液。將濾液稀釋后經離子色譜分析。

2 結果與分析

2.1分離條件的選擇

淋洗液中OH-有兩種作用：首先，作為淋洗離子，OH-濃度增大，淋洗能力增強，糖在色譜柱上的保留時間縮短；其次，OH-提供糖解離為離子所需要的pH值環境，OH-濃度增大，糖分子的離子化程度提高，其在色譜柱上的保留時間延長。因此，糖在色譜柱上的保留時間是兩種行為共同作用的結果。由于單糖分子結構、官能團構型十分相似，采用等度洗脫時分離效果較差，因此，采用KOH梯度洗脫的方法，分離效果如圖1所示。在選定的色譜條件下，果糖與L-山梨糖雖然未完全分離，但分離度能夠滿足要求，其余組分分離效果非常好，且所有目標峰峰形良好，靈敏度較高。

圖1 8 種糖標準品分離色譜圖Fig.1 Ion chromatographic separation of eight sugar standards

2.2前處理方法的優化

在利用離子色譜法對葡萄酒樣品中糖的測定時，起干擾作用的雜質主要有偶氮染料（色素）和氨基酸。偶氮染料濃度過大會對離子色譜柱造成傷害，因此實驗過程中必須進行脫色。于20.0 mL離心管中分別加入0.2 g C18和石墨化炭黑填料，然后加入稀釋20倍的紅葡萄酒樣品10.0 mL，超聲10 min后離心，取上層清液觀察吸附前后溶液顏色的變化，結果見圖2；將C18及石墨化炭黑作為填料裝填成SPE柱并利用其對紅葡萄酒樣品進行前處理，取濾液經稀釋后進行離子色譜分析，分析結果見圖3。

圖2 吸附劑吸附前后溶液顏色的變化Fig.2 Color variations of wine before and after adsorption

由圖2和圖3對比可以得出，石墨化炭黑可以更好地去除葡萄酒樣品中的雜質，測試結果受雜質影響更小。這是由于偶氮染料多含有苯環，近似平面結構，而石墨分子本身具有片層結構，這就使偶氮染料較容易吸附在石墨化炭黑表面，進而將顏色脫去。但是其在脫色的同時，又會吸附部分糖分子，造成回收率較差的問題。而回收率差的問題可以用回收系數進行校正。C18做填料脫色效果較差，離子色譜峰受雜質的影響較大，但是其對糖的回收率較高。綜合各種影響因素，對葡萄酒中糖的的測定中，選用石墨化炭黑做SPE柱的填料。

圖3 不同SPE柱處理過后樣品離子色譜圖對比Fig.3 Comparison of ion chromatograms based on separation with different SPE columns

2.3標準曲線

在選定條件下對混合標準溶液進行離子色譜分析，測試8種糖的標準曲線，標準曲線參數見表3。由標準曲線及其參數可知，在線性范圍內，相關系數R2≥99.87%。8種糖的檢出限（進樣量10μL，RSN=3）分別為0.007、0.004、0.005、0.005、0.003、0.014、0.016 mg/L和0.020 mg/L，且均具有較寬的線性范圍（0.06～30 mg/L）。

表3 標準曲線的線性范圍、檢出限、定量限Table 3 Linear curve equations, limits of detection and limits of quantification for surgars

2.4加標回收率及精密度

為了測試出離子色譜法串聯安培檢測器方法的準確性，并測試出準確性參數，選取一不含木糖、L-山梨糖、蔗糖、異麥芽酮糖和麥芽糖，且阿拉伯糖、葡萄糖及果糖含量低的樣品作為空白基質樣品，測定其阿拉伯糖、葡萄糖及果糖含量，定為本底質量濃度。平行取3份樣品，分低、中、高3個水平，分別添加一定量混合標準溶液，使各組分添加量分別為200.0、500.0、1 000.0 mg/kg。添加標準溶液后，按2.2節步驟進行前處理，平行6次，測定加標回收率及相對標準偏差，測定結果見表4。

表4 加標回收率及相對標準偏差Table 4 Recover and precision, expressed as relative standard deviation (RSD), of this method

由表4可以看出，在線性范圍內的加標回收率在81.5%～95.1%之間，相對標準偏差在4.9%～8.7%之間，表明方法精密度可滿足分析要求，回收率雖然較差，但是可以通過大量實驗數據歸納校正因子的方法進行校正。

2.5樣品分析

表5 樣品分析實驗結果Table 5 Anlytical results obtained for real samples mg/L

續表5mg/L

由表5得出，進口葡萄酒中主要含有一種國標中未列入的天然糖：阿拉伯糖，并含有大量的葡萄糖和果糖，少量葡萄酒樣品中含有L-山梨糖，未檢出蔗糖與麥芽糖。其中阿拉伯糖為葡萄生長過程中產生，非人工添加結果檢出。

3 結 論

通過實驗得出葡萄酒中含有葡萄糖、果糖和阿拉伯糖3種天然糖。甜型或半甜型（半干型）葡萄酒樣品中3種糖的總量遠高于干型葡萄酒中的含量，這是由于干型葡萄酒在釀造過程中比甜型葡萄酒增加了一步脫糖工藝。少量葡萄酒樣品中含有L-山梨糖，含量較低。通過本方法檢測葡萄酒樣品中糖的含量具有前處理方法簡單，易于操作的優點，適用于葡萄酒樣品中8種常見天然糖的含量測定。

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Determination of Naturally Occurring Sugars in Wine by Ion Chromatography with Integrated Pulsed Amperometric Detection

MA Jiamin1,2, CUI He1,*, ZHANG Wenhao1, LI Li3, DONG Lizhen1, LI Huixin1
(1. Shandong Extry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qingdao 266001, China; 2.Qingdao University, Qingdao 266071, China; 3. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

We developed a method for the determination of eight naturally occurring sugars in wine by ion chromatography with integral amperometric detection. We used potassium hydroxide (KOH) produced by eluent generator electrolysis for gradient elution. On CarboPac PA20 anion exchange column, all eight target compounds could be separated completely in 30 minutes. The limits of detection ( LODs) of these analytes by the integral amperometric detector were very low, and a wide linear range was found. The relative standard deviations (RSDs) for six replicate determinations varied from 4.9%to 8.7%, and the recoveries of these eight sugars from spiked samples ranged from 81.5%to 95.1%. Our method proved to be simple, fast, sensitive and suitable for the analysis of the eight naturally occurring sugars in wine by achieving good separation without derivatization.

ion chromatography (IC); integral amperometric detector (IAD); wine; naturally occurring sugar

O657.75

A

1002-6630（2015）12-0108-05

10.7506/spkx1002-6630-201512020

2014-09-28

國家重大科學儀器研發專項（2012YQ090229）；國家質檢公益性科研專項（201210012）

馬甲民（1988—），男，碩士研究生，研究方向為離子色譜及應用。E-mail：jiaminma@126.com

*通信作者：崔鶴（1962—），男，研究員，博士，研究方向為色譜及色譜聯用技術。E-mail：cuihe88@aliyun.com