3 種酵母發酵生產紅樹莓酒香氣成分的GC-MS分析

劉亞娜，楊 華，郭德軍,*

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

3 種酵母發酵生產紅樹莓酒香氣成分的GC-MS分析

劉亞娜1，楊 華2，郭德軍1,*

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319）

以D254、71B、D153種果酒酵母進行發酵制備紅樹莓酒，并分析其香氣化學成分。采用頂空-固相微萃取法提取3種酵母釀造的紅樹莓酒香氣成分；利用氣相色譜-質譜進行香氣成分的分離測定，結合計算機檢索技術對分離化合物進行鑒定，利用峰面積歸一法測定各香氣化學成分的相對含量，共鑒定出105種香氣成分，其中D254、71B、D15酵母發酵的紅樹莓酒中分別檢測出35、48、57種香氣成分，共有8種成分相同。D254酵母發酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇（54.39%）；71B酵母發酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為丙烯酸異辛酯（12.41%）、脫羰秋水仙堿（12.06%）、癸酸乙酯（8.21%）；D15酵母發酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為三辛酸甘油酯（11.06%）和安非拉酮（8.81%）。綜合氣相色譜-質譜分析與感官評價結果表明，71B酵母發酵生產的紅樹莓酒香氣較好，適宜大眾口味，從而得出71B酵母為生產紅樹莓酒的最優菌株。

紅樹莓酒；不同酵母；香氣成分；氣相色譜-質譜法

紅樹莓屬于薔薇科懸鉤子屬多年生落葉灌木，俗稱是“覆盆子”、“托盤”等[1]。紅樹莓富含豐富的營養物質，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、花青素、VE、氨基酸、鞣花酸等[2]，同時還含有黃酮、類黃酮[3-4]、白藜蘆醇等多種抗氧化物質，其中VE、SOD等成分的含量高于其他漿果，且具有美容、抗衰老、增強免疫力、抗癌、抗心血管疾病等功效[5]。以紅樹莓為原料釀制的紅樹莓酒，具有低酒精體積分數、高營養、益腦健身、促進血液循環、加快機體的新陳代謝、平衡體內膽固醇水平、改善心腦血管功能，同時具有利尿、激發肝功能等保健功效[6]。隨著人們對身體健康的重視程度逐漸加深，紅樹莓酒具有廣泛的應用前景。

本實驗選取3種不同酵母對相同的紅樹莓果汁采取相同工藝進行發酵，采用頂空-固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）法提取酒樣中的香氣化學成分[7]，并利用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法對不同酵母發酵生產的紅樹莓酒香氣化學成分進行鑒定[8]，通過對比分析研究不同酵母發酵釀造紅樹莓酒的主要香氣化學成分組成及相對含量的差異，選取出優良的釀酒酵母[9]，從而為紅樹莓酒香氣化學成分的分析研究和感官風味評價體系的建立提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

紅樹莓（主要成分含量：水分5 6%、總糖5.6 g/100 g、pH 3.22、蛋白質0.2 g/100 g、灰分0.5 g/100 g、花青素42.1 mg/100 g） 大興安嶺超越公司；果酒干酵母D254煙臺帝伯仕自釀機有限公司；果酒干酵母71B法國拉氟德公司；果酒酵母D15黑龍江八一農墾大學食品學院微生物實驗室；果膠酶（2 000 U/g） 生工生物工程股份有限公司。

1.2儀器與設備

7890A/5975GC-MS聯用儀 美國Agilent公司；固相微萃取裝置、聚二甲基硅氧烷/二乙基苯100 ?m萃取頭美國Supelco公司。

1.3方法

1.3.1紅樹莓酒的制備

圖1 紅樹莓酒制備工藝流程圖Fig.1 Flow diagram for the production of red raspberry wine

圖1為紅樹莓酒制備的工藝流程圖，制備過程中操作要點如下：

1）制備紅樹莓酒：紅樹莓過濾取果汁，添加質量分數0.4%果膠酶，50 ℃恒溫水浴2 h，添加蔗糖200 g/L，添加CaCO3調整pH值使紅樹莓果汁pH值為4.0。

2）酵母的活化：干酵母處于休眠期，活化可以使干酵母脫離休眠期從而恢復酵母細胞的正常功能，增強酵母活性。D254和71B干酵母活化處理：分別取D254干酵母和71B干酵母1 g，35～40 ℃條件下置于20 mL質量分數2%蔗糖溶液中并攪拌15 min，30 ℃恒溫靜置1.5 h后即可使用[10]。D15酵母活化處理：取—80 ℃冷凍D15酵母于常溫解凍，接種在酵母浸出粉胨葡萄糖培養基后28℃恒溫搖床搖菌1 d即可使用[11]。

3）接種：將活化后的3種酵母菌制得的酵母分別按質量分數7%接種量接種于200 mL澄清紅樹莓果汁中，26℃恒溫發酵8 d。

1.3.2紅樹莓酒香氣成分分析

取30 mL紅樹莓酒樣品置于50 mL頂空瓶中，加入0.1 g/mL NaCl溶液，并以聚四氟乙烯隔墊密封，置于70℃條件下萃取40 min后，將萃取針插入GC進樣口，解吸1.5 min[12]，同時啟動儀器，分析樣品并采集數據。

1.3.3 GC-MS分析條件

利用GC-MS測定其香氣化學成分的種類及各成分相對含量，對比分析3種酵母發酵生產的紅樹莓酒香氣化學成分共同點及差別，確定釀造紅樹莓酒的最優酵母菌株。

1.3.3.1 GC條件[13]

DB-5MS色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25μm）；升溫程序：初始溫度80℃保持5 min，以5℃/min升至270℃，保持1 min；傳輸線溫度230℃；載氣為高純He（99.999%）；載氣流速1.0 mL/min。

1.3.3.2 MS條件

進樣口溫度250℃；電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度250℃；四極桿溫度150℃；質量掃描范圍50～550 u；對采集到的質譜圖利用NIST 08.L譜庫進行檢索，并用峰面積歸一化定量計算出各香氣成分在3種紅樹莓酒樣中的相對含量。

1.3.4紅樹莓酒感官評定

紅樹莓酒的評分標準參照中國葡萄酒品評標準，得分由項目組10名成員品評后打分，取平均值[14-15]，評分標準見表1。感官要求：色澤：深紅色，有光澤，澄清透明；香氣：果香、酒香濃馥優雅、悅人；口味：醇厚協調、舒服、爽口、回味延綿；風格：風格獨特，幽雅無缺[16]。

表1 紅樹莓酒感官評分標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of red raspberry wines

1.3.5 紅樹莓酒理化指標測定

酒精體積分數、總糖含量和總酸含量的測定：分別采用GB/T 15038—1994《葡萄酒、果酒通用試驗方法》蒸餾比重法、斐林試劑滴定法和電位滴定法。

2 結果與分析

2.1不同酵母發酵的紅樹莓酒中香氣成分GC-MS分析

表2 3 種不同酵母發酵的紅樹莓酒及紅樹莓果汁主要香氣成分Table 2 Main aroma components of red raspberry wines fermented with three different yeast strains and raspberry juice

續表2

續表2

如表2所示，采用HS-SPME和GC-MS技術在3種酒樣中共鑒定出105種香氣成分，主要是醇類14種、酯類37種、酸類5種、烷烯烴類19種、醛酮類9種、苯酚類5種、其他類16種；而在紅樹莓果汁中共鑒定出32種香氣成分，主要為醇類4種、酯類8種、酸類1種、烷烯烴類6種、醛酮類2種、苯酚類4種、其他類7種。

圖2 2DD225544（A）、71B（BB）、DD1155（C）酵母發酵生產的紅樹莓酒香氣成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 Total ion current chromatograms of red raspberry wine fermented with D254(A), 71B(B), and D15(C) yeast strains and raspberry juice by GC-MS

由圖2和表2可知，在D254酵母釀造的樹莓果酒中，共檢測出35種香氣成分，占總峰面積的97.94%。其中，醇類58.79%、酯類21.74%、酸類0.86%、烷烯烴類12.67%、醛酮類1.09%、苯酚類0.79%、其他類2.00%。其主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇（54.39%）、正己酸乙酯（5.31%）、環三聚二甲基硅氧烷（4.74%）、苯乙醇（2.86%）、丁酸-1-乙烯基-1,5-二甲基-4-己烯基酯（2.78%）。在71B酵母釀造的樹莓酒中，共檢測出48種香氣成分，占總峰面積的83.03%。其中，醇類4.83%、酯類50.16%、酸類0.39%、烷烯烴類7.62%、醛酮類1.24%、苯酚類5.01%、其他類14.42%。其主要香氣成分為丙烯酸異辛酯（12.41%）、脫羰秋水仙堿（12.06%）、癸酸乙酯（8.21%）、9-十六碳烯酸乙酯（7.21%）、辛酸乙酯（5.23%）、六甲基環三硅氧烷（3.13%）、1,3-二（三甲基甲硅烷基）苯（2.90%）、正己酸乙酯（2.84%）。在D15酵母釀造的樹莓酒中，共檢測出57種香氣成分，占總峰面積的86.11%。其中，醇類9.41%、酯類29.89%、酸類7.42%、烷烯烴類17.27%、醛酮類9.08%、苯酚類4.37%、其他類8.67%。其主要香氣成分為三辛酸甘油酯（11.06%）、安非拉酮（8.81%）、3-甲基-1-丁醇（7.15%）、八甲基三硅氧烷（6.80%）、2-（三氟甲基）苯甲酸（6.05%）、六甲基環三硅氧烷（4.52%）、正二十烷（3.67%）、4-十八基嗎啉（3.32%）、3,5-二叔丁基-1,2-苯二酚（3.03%）、十二酸乙酯（2.90%）、癸酸乙酯（2.60%）、酯二十四烷酸乙酯（2.57%）。

2.2不同酵母發酵的紅樹莓酒的主要香氣成分比較分析

國內外較多報道葡萄酒的釀造工藝與香氣成分分析[17-20]，對紅樹莓酒釀造工藝報道較多，而對香氣成分測定分析較少，因此本實驗采用HS-SPME法提取對紅樹莓酒中的香氣成分進行分析。酒的香氣成分中醇類和酯類占的相對含量較高，其中醇類物質在呈香上起主要作用[21]，同時又是形成酯類物質的前體，3種酵母發酵生產的果酒及紅樹莓果汁中醇類物質相對含量分別為58.79%、4.83%、9.41%、5.11%。含量差距較大，其中71B酵母發酵生產的紅樹莓酒中醇類物質相對含量較紅樹莓果汁低0.28%，說明此種酵母對醇類物質有降低的作用，而D254酵母與D15酵母發酵生產的紅樹莓酒中醇類物質相對含量分別較紅樹莓果汁高出53.68%與4.30%，其中相對含量最高的物質都是3-甲基-1-丁醇分別為54.39%與7.15%；但71B酵母發酵生產的紅樹莓酒中并不含3-甲基-1-丁醇，說明并非所有酵母發酵生產的紅樹莓酒中都會產生3-甲基-1-丁醇。3-甲基-1-丁醇具有青草、植物香氣，這種香氣具有持久保持的作用，因此在食品工業中用于調香[22]。D254酵母發酵產生醇類物質含量較高，因此適宜于快速發酵生產酒精體積分數稍高的紅樹莓酒。通常醇類物質具有刺鼻的氣味，對于果酒的酒香有負效應影響，但D254酵母與71B酵母發酵的果酒中共有的醇類物質苯乙醇不同于其他醇類物質，不僅具有殺菌作用，而且還會產生玫瑰和茉莉花香，給人柔和愉悅的感覺[23]。

紅樹莓果實以酯類為香氣的主要來源，而通過3種酵母發酵生產的紅樹莓酒中，其相同的香氣成分并不多，且含量區別較大，說明紅樹莓果汁發酵后其香氣成分有較大的改變。本研究中，在3種紅樹莓酒中共檢測出酯類物質37種，其中共有酯類物質6種。71B酵母中酯類物質的相對含量更高達50.16%，較紅樹莓果汁高1.36%，且其主要的酯類物質分別為丙烯酸異辛酯、癸酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、辛酸乙酯；而D254酵母與D15酵母發酵生產的紅樹莓酒中酯類物質相對含量分別為21.74%、29.89%，較紅樹莓果汁分別低27.06%、18.91%，而其主要的酯類物質分別為正己酸乙酯、三辛酸甘油酯。大多數酯類具有花、果香氣，如：辛酸乙酯略帶有玫瑰、橙子的花果香氣，此香味為白蘭地酒特有的香氣；癸酸乙酯具有葡萄的水果香氣[13]；正己酸乙酯具有似蘋果、香蕉味、梨的酸甜味的水果香氣。由此，發酵過程所選擇的發酵酵母菌株不同對其發酵所產生的酯類化合物的種類與相對含量有很大的影響，且酯的種類與相對含量的不同會決定酒的香味和風格。

以D254酵母和71B酵母發酵產生的紅樹莓酒中的酮類物質較少，其含量均低于紅樹莓果汁；而釀酒酵母D15發酵生產的紅樹莓酒中的酮類物質相對含量較紅樹莓果汁高6.12%，其中酮類物質主要為安非拉酮，其相對含量高達8.81%。安非拉酮是非苯丙胺類，有抑制食欲的作用，可使人產生飽腹感，從而起到控制食欲、降低食量的作用[24]，并且安非拉酮對心血管系統的影響較小，因此可用于具有輕度心血管疾病的肥胖病人的輔助治療[25]。

3種不同酵母發酵生產的紅樹莓酒中共檢測出酸類物質5種，且其中沒有共有酸類物質，在D15酵母發酵的紅樹莓酒中產生酸性物質相對含量較高的是2-（三氟甲氧基）苯甲酸，其相對含量為6.05%；其他2種酵母發酵生產的紅樹莓酒中酸類物質相對含量都很少。2-（三氟甲氧基）苯甲酸對呼吸系統具有刺激性，并且使酒具有酸澀感，且酸類化合物的呈香性相對比較小，對紅樹莓酒的香味影響較小。

3種紅樹莓酒中醇類和酯類所占的相對含量較高，因此其在果酒的香氣中起到主要的作用，而烷烴類、醛酮類、酚類、苯環類和其他16種成分所占的相對含量較少，對紅樹莓酒香氣影響較小。

2.3感官評定與理化指標測定分析

表 3 紅樹莓酒理化指標測定Table 3 Physical and chemical parameters of red raspberry wines fermented with D254,71B and D15 yeast strains

對紅樹莓酒進行感官評定和理化指標測定，結果見表3。71B酵母產酒能力強，殘糖少，酸度較低，感官評定總分較高，且風格與口味較佳；D254酵母產酒能力強，酸度較低，但感官評定總分低，風味、口感皆不佳；D15酵母產酒香氣較佳，但酒口感酸澀，缺乏紅樹莓酒應有的風格與口味。

3 結 論

采用HS-SPME提取待研究不同酵母發酵生產的紅樹莓酒樣中的香氣化學成分，并通過GC-MS進行分析檢測。3種酒樣中共檢測出香氣化學成分105種，其中8種為共有香氣成分，在D254、71B酵母和D15酵母發酵的紅樹莓酒中檢出香氣成分分別為35、48、57種，并用峰面積歸一化法來定量分別計算出各香氣成分在3種酒樣中的相對含量，經檢測可知3種酒之間的香氣組分及相對含量差別均較大。D254酵母發酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為3-甲基-1-丁醇，相對含量為54.39%；71B酵母發酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為丙烯酸異辛酯，相對含量為12.41%；D15酵母發酵的紅樹莓酒的主要香氣成分為三辛酸甘油酯，相對含量為11.06%。研究結果表明，以不同酵母發酵的紅樹莓酒香氣成分差異顯著，因此酵母菌種選取對紅樹莓酒香氣成分組成及相對含量具有重要的影響。由于紅樹莓酒中香氣成分種類繁雜，因此各成分之間協同，抑制作用強烈，從而使其香氣成分出現增加或減少的現象，會影響紅樹莓酒的感官風味。此外，鑒定紅樹莓酒除評價其特征香氣，還結合人體嗅覺感官分析，實驗表明以71B酵母為發酵菌種的紅樹莓酒香氣清新，有玫瑰花香，且色澤澄清，呈櫻桃紅色，口感柔和，無酸澀感，無過重的酒味。綜合GC-MS分析及感官評定結果，選取71B酵母為釀造紅樹莓酒的最優菌種。

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GC-MS Analysis of Arom Chemical Composition of Red Raspberry Wines Fermented with Three Different Yeast Strains

LIU Yana1, YANG Hua2, GUO Dejun1,*

(College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

The aroma components of red raspberry wines fermented with three different wine yeast strains, D254, 71B and D15, were extracted with headspace-solid phase micro extraction (HS-SPME) and then separated and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) through mass spectral library search. Total ion current (TIC) peak area normalization method was used to determine the relative contents of aroma components. A total of 105 flavor components were detected, among which 35, 48 and 57 compounds were detected in red raspberry wines fermented with D254, 71B and D15, respectively, with 8 being common to these three samples. The main aromatic compound in red raspberry wine fermented with D254was 1-buten-ol-3-methyl (54.39%) while those in the wine fermented with 71B were 2-propenoic acid octyl ester (12.41%), demecolcine (12.06%) and ethyl caprate (8.21%), and were glycerol tricaprylate (11.06%) and amfepramone (8.81%) in the wine fermented with D15. Overall, GC-MS analysis and sensory evaluation suggested that red raspberry wine fermented by 71B contains more aroma substances and is suitable for the pubic taste. Thus, 71B could be the best yeast strain for the production of red raspberry wine.

red raspberry wine; yeast strain; aroma components; gas chromatography-mass spectrometry

TS207.3；TS261.1

A

1002-6630（2015）12-0160-06

10.7506/spkx1002-6630-201512030

2014-11-07

農墾總局技術開發課題（HNK13KF-15-01）

劉亞娜（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：985974520@qq.com

*通信作者：郭德軍（1968—），男，教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：187013609@qq.com