角鯊烯國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制

陳偉珠，晉文慧，方 華，謝全靈，張怡評(píng)，洪 專,*

（1.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005；2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005）

角鯊烯國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制

陳偉珠1,2，晉文慧1，方 華1，謝全靈1，張怡評(píng)1，洪 專1,*

（1.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，福建 廈門 361005；2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，化學(xué)生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005）

為研制角鯊烯國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品。以角鯊烯粗品為原料，制備高純角鯊烯，采用紅外光譜、高分辨質(zhì)譜和核磁共振譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。樣品分裝成150 瓶后，采用氣相色譜-氫火焰離子化檢測(cè)器法進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)和定值分析。從樣品中隨機(jī)抽取15 瓶進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，經(jīng)F檢驗(yàn)表明在95%置信區(qū)間范圍內(nèi)樣品均勻性良好；穩(wěn)定性考察按照-18 ℃長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性（24 個(gè)月）進(jìn)行，結(jié)果表明在考察期間內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好；標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)國(guó)內(nèi)8 家具有分析資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同定值，并評(píng)定了定值結(jié)果的不確定度，角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果為99.57%，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為0.30%（k=1.96）。該標(biāo)準(zhǔn)樣品達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)要求，可用于有關(guān)角鯊烯的方法校正和質(zhì)量控制。

角鯊烯；標(biāo)準(zhǔn)樣品；氣相色譜-氫火焰離子化法；定值；不確定度

角鯊烯，又稱魚肝油萜，也稱鯊烯，是一種天然的開(kāi)鏈三萜烯類、多不飽和脂肪族烴類化合物，含有6 個(gè)非共軛雙鍵，是由日本化學(xué)家于1906年在鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，是人類從動(dòng)物組織中最早發(fā)現(xiàn)的烴類化合物[1-2]，其化學(xué)名稱為2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯[3]。目前，角鯊烯主要來(lái)自于深海鯊魚肝油，同時(shí)也少量存在于油脂不皂化物中，尤其在橄欖油、棕櫚油及其脫臭餾出物中含量較多，菜籽油、大豆油、米糠油、棉籽油等植物油也含有一定量的角鯊烯[4-5]。角鯊烯在體內(nèi)參與膽固醇的生物合成及多種生化反應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體新陳代謝，提高機(jī)體的防御機(jī)能及應(yīng)激能力，具有抗衰老、抗腫瘤和提高免疫調(diào)節(jié)等多種生理功能，可廣泛地應(yīng)用于化妝品、醫(yī)藥、食品等多個(gè)行業(yè)[6-7]。市場(chǎng)上角鯊烯相關(guān)的產(chǎn)品不計(jì)其數(shù)，產(chǎn)品中角鯊烯的含量檢測(cè)需要角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品作為檢測(cè)對(duì)照；且在角鯊烯的相關(guān)研究和開(kāi)發(fā)中，也需要角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品作為檢測(cè)基準(zhǔn)，但是目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品。因此迫切需要開(kāi)展角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

正己烷、甲醇（均為色譜純） 德國(guó)默克公司；實(shí)驗(yàn)用水均來(lái)自Milli-Q純水系統(tǒng)。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A系列氣相色譜（gas chromatography，GC）儀（配有氫火焰離子檢測(cè)器（flame ionization detection，F(xiàn)ID）） 美國(guó)Aglient公司；HP-8452型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)惠普公司；Nicolet Ftir-670型紅外光譜儀美國(guó)Thermo Scientific公司；LCT PremierTMXE型高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司；AL/104型天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；Milli-Q純水機(jī) 美國(guó)Milli-Pore公司；New style半制備液相儀 江蘇漢邦科技公司。

1.3 方法

1.3.1 角鯊烯樣品的制備

圖1 角鯊烯粗品的高效液相色譜圖（A）和單體的GC圖（B）Fig.1 Semi-preparative HPLC and GC profiles of squalene

以角鯊烯粗品為原料，經(jīng)高效液相色譜純化分離，收集主峰，去純?nèi)軇@得角鯊烯單體。制備角鯊烯樣品液相色譜條件：SB-C18色譜柱（150 mm×21.2 mm， 4.6 μm）；流動(dòng)相：甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流速15 mL/min；進(jìn)樣量0.5 mL；樣品質(zhì)量濃度10 mg/mL（正己烷溶解）。

制備角鯊烯樣品液相色譜圖如圖1A所示，角鯊烯主峰約在22 min出峰，收集該主峰流出液，去除溶劑，得到的角鯊烯單體經(jīng)GC法檢測(cè)，純度大于99%，色譜圖見(jiàn)圖1B。

1.3.2 定性分析

采用紅外吸收光譜、高分辨質(zhì)譜及核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）譜等對(duì)角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性分析。

1.3.3 定值分析

標(biāo)準(zhǔn)樣品定值一般情況下采用技術(shù)有效、嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)可的方法來(lái)完成。目前，關(guān)于角鯊烯檢測(cè)方法有GC法[8-13]、GC-質(zhì)譜法[14-16]、高效液相色譜法[2,7,17-20]以及超高效液相色譜法[21]，但是尚無(wú)統(tǒng)一的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，所以本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[10]采用GC-FID法。

GC-FID條件：HP-5色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱流量1.0 mL/min；分流進(jìn)樣（分流比1∶30）；進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度300 ℃；升溫程序：初始柱溫160 ℃，保持2 min，以速率15 ℃/min升至280 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至300 ℃，保持8 min；FID溫度330 ℃；進(jìn)樣口壓力15 psi；載氣為高純氮?dú)猓?9.999%），流速1 mL/ min，尾吹25 mL/ min；燃燒氣：氫氣，流速30 mL/ min；助燃?xì)猓嚎諝猓魉?00 mL/min。

1.3.4 樣品配制

取本品10 mg置于10 mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，即得。

1.3.5 均勻性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性是指特性量值在空間分布的均勻程度，它是對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品總體空間分布的評(píng)價(jià)，是標(biāo)準(zhǔn)樣品的重要質(zhì)量指標(biāo)之一。對(duì)同一批制備的角鯊烯樣品進(jìn)行分裝，每瓶標(biāo)準(zhǔn)樣品凈質(zhì)量為50 mg，共150 瓶。按照GB/T 15000.3—2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品：定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法》[22]規(guī)定，本項(xiàng)目確定抽樣數(shù)目為15 個(gè)，采用單因素多水平試驗(yàn)方差分析法對(duì)角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗(yàn)，測(cè)定方法采用GCFID，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)3 次。檢測(cè)數(shù)據(jù)用方差分析法進(jìn)行分析以判斷標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性是否合格。

1.3.6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

考察樣品的穩(wěn)定性，確定其有效期，取本標(biāo)準(zhǔn)樣品模擬上市包裝，進(jìn)行-18 ℃、24 個(gè)月長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)，分別于0、1、3、6、9、12、18、24 個(gè)月取樣檢測(cè)，通過(guò)考察標(biāo)準(zhǔn)樣品純度的變化來(lái)研究樣品的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性檢測(cè)方法與均勻性檢測(cè)的方法相同，均采用GC-FID法，每份樣品連續(xù)進(jìn)樣2 次，然后用歸一法求出其純度的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 角鯊烯的定性分析

角鯊烯通過(guò)紅外光譜、高分辨質(zhì)譜及NMR譜進(jìn)行定性分析。

2.1.1 角鯊烯的紅外光譜分析

表1 角鯊烯紅外光譜數(shù)據(jù)表Table 1 IR spectral parameters of squalene

如表1所示，波數(shù)為2 969、2 854、1 380 cm-1說(shuō)明樣品結(jié)構(gòu)中存在CH3。波數(shù)為2 922、1 443 cm-1說(shuō)明樣品結(jié)構(gòu)中存在與雙鍵相連的CH2。波數(shù)為1 666、835 cm-1說(shuō)明樣品結(jié)構(gòu)中存在三取代的烯烴。

2.1.2 角鯊烯的高分辨質(zhì)譜分析

高分辨質(zhì)譜測(cè)得的角鯊烯加鈉離子[C30H50+Na]+精確質(zhì)荷比為m/z 433.379 7，與理論值（433.380 5）一致。

2.1.3 角鯊烯的NMR圖譜分析

對(duì)該樣品進(jìn)行NMR測(cè)試，核磁數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的角鯊烯核1H NMR圖譜和13C NMR圖譜等數(shù)據(jù)一致。從樣品的紅外光譜、高分辨質(zhì)譜和NMR譜證明了所研制的樣品是角鯊烯，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2。

圖2 角鯊烯的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structure of squalene

表2 角鯊烯的NMR數(shù)據(jù)表Table 2 NMR data of squalene

2.2 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性檢驗(yàn)是標(biāo)準(zhǔn)樣品研制過(guò)程中不可缺少的程序。因此在對(duì)樣品進(jìn)行分裝后，對(duì)角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗(yàn)，均勻性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品純度均勻性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Homogeneity of purified squalene%

表4 角鯊烯均勻性方差分析的結(jié)果Table 4 Results of variance analysis for the homogeneity of squalene

統(tǒng)計(jì)量F值為1.75，小于F0.05（14,30）值2.04，說(shuō)明在95%的置信區(qū)間，角鯊烯樣品均勻性良好。

2.3 穩(wěn)定性

取本標(biāo)準(zhǔn)樣品，模擬上市包裝，在溫度-18 ℃條件下放置24 個(gè)月，分別于0、1、2、3、6、9、12、18、24 個(gè)月取樣，按穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。根據(jù)GB/T 15000.3—2008的要求，采用直線模型作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑢?duì)長(zhǎng)期穩(wěn)定性獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表5 角鯊烯樣品在—18 ℃貯存條件下的穩(wěn)定性Table 5 Stability of squalene at-1188 ℃

斜率b1按公式（1）計(jì)算：

式中：Xi為每次檢測(cè)時(shí)間/月；Yi為每次檢測(cè)純度/%；為每次檢測(cè)時(shí)間總和/間隔檢測(cè)次數(shù)（X=10.29月）；為檢測(cè)純度結(jié)果的平均值（）。

截距b0按公式（2）計(jì)算：

直線上點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)差按公式（3）計(jì)算：

式中：n-2為自由度。

取其平方根S為0.042 802%，與斜率相關(guān)的不確定度按公式（4）計(jì)算：

自由度為n-2和P=0.95（95%置信水平）的學(xué)生t因子等于2.571。由于|b1|＜t0.95(n-2)×s（b1）= 2.571×0.002 066%=0.005 311%，故斜率是不顯著的。因而未觀測(cè)到不穩(wěn)定性。長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性的不確定度貢獻(xiàn)度即成為：ults=sb×t=0.002 066%×24=0.05%。直線模型分析的結(jié)果，表明角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品在低溫密閉環(huán)境中保存2 a穩(wěn)定性良好。這說(shuō)明在實(shí)際保藏條件下（-18 ℃），角鯊烯的有效期可定為2 a。

2.4 定值結(jié)果及其不確定度評(píng)定

2.4.1 定值結(jié)果

本標(biāo)準(zhǔn)樣品按照GB/T 15000.3—2008要求，采用多個(gè)實(shí)驗(yàn)室協(xié)作實(shí)驗(yàn)定值，選擇獲得國(guó)家或部門認(rèn)可的、具備資質(zhì)的8 家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品定值。隨機(jī)抽取8 瓶樣品，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室送1 瓶，采用GC-FID法進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)用面積歸一法進(jìn)行定值，定值結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 角鯊烯的定值結(jié)果Table 6 Certification results of squalene%

匯集各家實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)數(shù)據(jù)后，對(duì)每家實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)按大小順序排列，用Grubb’s法和峰度法正態(tài)性檢驗(yàn)組內(nèi)數(shù)據(jù)的異常值。沒(méi)有異常值，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步統(tǒng)計(jì)，再用Grubb’s法對(duì)每家實(shí)驗(yàn)室的平均值進(jìn)行檢驗(yàn)，將其看成一組測(cè)定值進(jìn)行異常值檢驗(yàn)，無(wú)異常值。因此將各家實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的數(shù)據(jù)作為無(wú)偏估計(jì)值，計(jì)算8 家測(cè)定結(jié)果的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。然后對(duì)各實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行Cochran檢驗(yàn)，按公式（5）計(jì)算統(tǒng)計(jì)量：

式中：Si為各實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差；Smax為Si中的最大值。表明各實(shí)驗(yàn)室間的測(cè)量不屬于等精度測(cè)量，因此計(jì)算加權(quán)平均值作為最佳值得到角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果。總平均值x=99.57%。

2.4.2 定值結(jié)果的不確定度評(píng)定

根據(jù)GB/T 15000.3—2008規(guī)定，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成。標(biāo)準(zhǔn)樣品特性標(biāo)準(zhǔn)值的測(cè)量不確定度UCRM由標(biāo)準(zhǔn)值定值實(shí)驗(yàn)的不確定度U（x）、均勻性檢驗(yàn)的不確定度Ubb和穩(wěn)定性檢驗(yàn)的不確定度Ults組成。依據(jù)全部測(cè)定結(jié)果，計(jì)算角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度。

標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的不確定度為Uchar=0.14%。

均勻性檢驗(yàn)的不確定度Ubb：瓶間方差按公式（6）計(jì)算：

式中：組間均方差、組內(nèi)均方差數(shù)據(jù)來(lái)自表4。

瓶間標(biāo)準(zhǔn)差是該方差的平方根：

穩(wěn)定性檢驗(yàn)的不確定度Ults：由2.3節(jié)穩(wěn)定性檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)可知，ults=sb×t=0.002 066%×24=0.05%，標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的不確定度為擴(kuò)展不確定度為U95=kU=1.96×0.15%=0.30%。

通過(guò)上述統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值定值結(jié)果為：特性標(biāo)準(zhǔn)值99.57%，置信度為95%的擴(kuò)展不確定度值為0.30%。

3 結(jié) 論

研制角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品，對(duì)其進(jìn)行了均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察。考察結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)樣品符合標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性與穩(wěn)定性的要求。研制的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)、衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫等方面的測(cè)量和科學(xué)研究提供了技術(shù)支撐和量值溯源保證，具有重要意義。

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[23] 陳全斌, 程忠泉, 楊建香, 等. 羅漢果種仁中角鯊烯的提取及其結(jié)構(gòu)表征[J]. 廣西植物, 2006, 26(7): 687-689.

Development of Squalene Certified Reference Material

CHEN Weizhu1,2, JIN Wenhui1, FANG Hua1, XIE Quanling1, ZHANG Yiping1, HONG Zhuan1,*
(1. Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China; 2. The Key Laboratory for Chemical Biology of Fujian Province, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

Squalene certified reference material was developed by purification of crude squalene. The structure of the certifi ed reference material was confi rmed by infrared spectroscopy (IR), high resolution mass spectrometry (HRMS) and nuclear magnetic resonance (NRM) and squalene was divided into 150 aliquots. The homogeneity and stability tests and quantitative analysis were carried out by gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID). Fifteen randomly selected aliquots showed good homogeneity as indicated by F-test analysis at a 95% confi dence interval. The test samples were stable at -18℃for 24 months. A cooperative certifi cation was conducted with 8 qualifi ed laboratories. The certifi ed purity value of the reference material was 99.57% with a relatively expanded uncertainty of 0.30% (k = 1.96). The reference material can conform to the technical requirement of the certifi ed reference material. This material was intended for use in the method validation and quality control regarding squalene.

squalene; certified reference material; gas chromatography-flame ionization detection (GC-FID); certification; uncertainty

P745

A

1002-6630（2015）12-0166-05

10.7506/spkx1002-6630-201512031

2014-10-30

廈門海洋研究開(kāi)發(fā)院共建項(xiàng)目（2014）；海洋生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化中試技術(shù)研發(fā)公共服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目（12PZP001SF10）；廣東海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目（GD2012-D01-001）

陳偉珠（1981—），女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)楹Ｑ筇烊划a(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品研制與分析。E-mail：wzchen@tio.org.cn

*通信作者：洪專（1970—），男，高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ筇烊划a(chǎn)物。E-mail：hzh@tio.org.cn