超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蜂蜜中雷公藤紅素和雷公藤次堿

雷美康，彭 芳，祝子銅，丁 濤，徐佳文，吳曉勤

（1.衢州出入境檢驗檢疫局技術中心，浙江 衢州 324002；2.江蘇出入境檢驗檢疫局食品實驗室，江蘇 南京 210001）

超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定蜂蜜中雷公藤紅素和雷公藤次堿

雷美康1，彭 芳1，祝子銅1，丁 濤2，徐佳文1，吳曉勤1

（1.衢州出入境檢驗檢疫局技術中心，浙江 衢州 324002；2.江蘇出入境檢驗檢疫局食品實驗室，江蘇 南京 210001）

建立了一種超高效液相色譜-串聯質譜同時檢測蜂蜜中雷公藤紅素和雷公藤次堿的快速分析方法。樣品用水溶解后，乙腈鹽析提取，采用Hypersil GOLD C18柱（50 mm×2.1 mm，1.9μm）分離，電噴霧離子源正離子多反應監測模式串聯質譜進行檢測。結果表明：雷公藤紅素和雷公藤次堿在0.01～20 ng/mL范圍內具有較好的線性關系，相關系數均大于0.997。該方法定量限均為0.05μg/kg。在0.05μg/kg和1.0μg/kg添加量條件下，雷公藤紅素和雷公藤次堿的回收率為69.9%～101.5%，相對標準偏差均不大于10%（n=6）。本方法快速、靈敏、準確，適用于蜂蜜中雷公藤相關物質殘留的定性、定量檢測。

超高效液相色譜-串聯質譜；蜂蜜；雷公藤紅素；雷公藤次堿

蜂蜜作為一種傳統的天然保健食品，主要是由蜜蜂采集植物花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜物質[1]。蜜蜂如果采集有毒植物的花粉，蜂蜜就可能混進有毒物質[2-5]，國內外關于使用有毒蜂蜜事件時有報道[6-9]。GB 14963—2011《蜂蜜》中明確規定蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露應安全無毒，不得來源于雷公藤（Tripterygium wilfordiiHook.F.）等有毒蜜源植物[1]。因此，建立蜂蜜中痕量雷公藤相關物質的快速篩查方法十分必要。

蜂蜜中雷公藤相關物質檢測方法報道較少，閆繼紅[10]介紹了采用化學檢驗方法定性判斷蜂蜜中是否含有雷公藤堿，此方法準確性和靈敏度低，同時檢測過程中需使用三氯化銻等危險化學品。郭艷紅等[11]采用高效液相色譜法檢測昆明山海棠蜜中雷公藤甲素，但溶劑消耗量大，耗時繁瑣、靈敏度低。雷公藤紅素和雷公藤次堿是雷公藤的主要毒性成分[12-16]，目前國內外同時檢測蜂蜜中雷公藤紅素和雷公藤次堿的方法尚未見報道。

本實驗建立了超高效液相色譜-串聯質譜同時測定蜂蜜中雷公藤紅素和雷公藤次堿的分析方法。該方法操作簡便、靈敏度高、結果準確，適用于蜂蜜中雷公藤相關物質的快速篩查和確證的檢測手段。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

蜂蜜樣品為浙江省衢州地區出口企業提供。

雷公藤紅素（≥98%）和雷公藤次堿（≥98%）南通飛宇生物科技有限公司；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，氯化鈉、無水硫酸鎂均為分析純。

Ultimate 3000超高效液相色譜-TSQ Vantage三重四極桿串聯質譜聯用儀、MULTIFUGE XIR高速離心機美國Thermo Scientific公司；MS 3 digital漩渦混合器 德國IKA公司。

1.2方法

1.2.1標準溶液的配制

標準儲備液：稱取雷公藤紅素和雷公藤次堿標準品10 mg（精確至0.1 mg）置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，混勻配制成100 mg/L的單標儲備液；標準中間液：分別準確移取1mL各單標儲備液置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成1.0 mg/L的混合標準中間液；標準工作液：根據需要移取適量混合標準中間液，用甲醇-水（1∶1，V/V）稀釋成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 ng/mL的標準工作溶液。各種標準溶液避光保存于4℃冰箱中。

1.2.2試樣制備

對未結晶的蜂蜜將其用力攪拌均勻，對有結晶析出的蜂蜜可將樣品瓶蓋塞緊后，置于不超過60℃的水浴中溫熱，待樣品全部融化后攪拌，迅速冷卻至室溫。在融化時必須防止水分揮發[17]。

1.2.3樣品前處理

稱取試樣5.0 g（精確至0.01 g）于50 mL具蓋離心管中，加入10 mL水溶解，加入10 mL乙腈、1 g NaCl、4 g無水硫酸鎂，搖勻，渦旋后離心（6 000×g，5 min），取上層溶液經0.22 ?m有機相濾膜過濾后用于分析。

1.2.4色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18柱（50 mm×2.1 mm，1.9μm）；柱溫：35℃；進樣量：2μL；流速：0.25 mL/min。流動相：A為水，B為含0.15%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～2.0 min，70%A；2.0～5.0 min，70%～5%A；5.0～10.0 min，5%A；10.1～14.0 min，70%A。

1.2.5質譜條件

掃描方式：正模式掃描；檢測方式：多反應監測；電噴霧電壓：+3 500 V；鞘氣：207 kPa；輔助氣：10 arb；；毛細管溫度：350℃；蒸發溫度：300℃；碰撞氣：氬氣（1.5 mTorr）。S-Lens電壓、碰撞電壓、掃描模式和保留時間等條件見表1。

表1 雷公藤紅素和雷公藤次堿的多反應監測質譜參數Table 1 Mass spectrometric parameters for the analysis of triptolide and wilforine by multiple reaction monitoring (MRM)

2 結果與分析

2.1色譜條件的優化

分別考察甲醇-水、酸化甲醇-水等流動相對雷公藤紅素和雷公藤次堿目標分析物的分離效果。結果表明，以酸化甲醇-水溶液為流動相時，目標物的分離度和峰形較好。雷公藤紅素和雷公藤次堿的多反應監測色譜圖如圖1所示。

圖1 雷公藤紅素（A）和雷公藤次堿（B）標準溶液（5 μg/kg）的多反應監測色譜圖Fig.1 Chromatograms of standards of triptolide and wilforine (5μg/kg) in MRM mode

2.2質譜條件的優化

將雷公藤次堿標準品溶液采用流動注射直接進樣，通過全掃描確定化合物母離子，再對母離子進行二級質譜掃描，得到碎片離子，通過優化S-Lens電壓、碰撞能量等參數進行優化，得到二級質譜圖。

分別考察電噴霧電離源的正離子和負離子模式和大氣壓力化學電離源的正離子和負離子模式4種電離方式，結果表明，目標物在ESI源的正離子模式條件下最佳。

通過SRM選擇相對豐度較高的離子對，確定為定量和定性離子對。同時，優化S-lens電壓、碰撞電壓等參數，優化后的質譜參數如表1所示。

2.3基質效應

分別以蜂蜜的空白提取凈化液作為標準溶液的稀釋液，以各組分的峰面積對質量濃度繪制基質加標標準曲線，將其斜率與標準品的標準曲線的斜率相比。結果表明經過凈化處理后對各目標測定物的基質效應影響不明顯[18]。

2.4方法的線性范圍和定量限

配制一系列不同質量濃度的混合標準工作溶液（0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 ng/mL），并依次進樣，分別以雷公藤紅素和雷公藤次堿的峰面積Y為縱坐標，以相應的質量濃度X為橫坐標，作標準曲線，結果表明：這2種目標物在0.01～20 ng/mL范圍內其質量濃度與峰面積呈良好的線性關系。雷公藤紅素和雷公藤次堿的線性方程分別為Y=-408.081+58 216.7X和Y=-166.356+14 146.4X，相關系數r大于0.997。以實際檢測時的信噪比大于10確定方法定量限均為0.05μg/kg。

2.5方法的回收率和精密度

分別在0.05μg/kg和1.00μg/kg水平下進行空白加標回收率實驗，每個水平重復6次，測定平均回收率及精密度。0.05μg/kg添加水平時雷公藤紅素和雷公藤次堿的回收率分別為69.9%～88.6%和84.3%～101.5%，相對標準偏差分別為9.2%和10%；1.0μg/kg添加水平時雷公藤紅素和雷公藤次堿的回收率分別為75.2%～93.1%和81.2%～99.8%，相對標準偏差分別為7.7%和7.9%，均符合殘留檢測的要求[19]。

3 結 論

本實驗建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜同時檢測蜂蜜中雷公藤紅素和雷公藤次堿殘留的分析方法。采用直接水溶解后離心凈化，有效提高了提取率，快速、簡潔。該方法作為蜂蜜中雷公藤相關物質殘留的確證和定量方法，具有簡便、快捷、準確的優點，可以用于蜂蜜的質量安全檢測和蜂蜜中毒事件中有毒樣品的定性和定量分析。

[1]衛生部. GB 14963—2011蜂蜜[S].北京:中國標準出版社, 2011.

[2]孟麗峰,刁青云,譯.健康的潛在威脅:蜂蜜中的吡咯里西啶類生物堿:上[J].中國蜂業, 2012, 63(9): 52-54.

[3]孟麗峰,刁青云,譯.健康的潛在威脅:蜂蜜中的吡咯里西啶類生物堿:下[J].中國蜂業, 2012, 63(10): 52-54.

[4]謝文聞,譯.蜂蜜中羥基馬桑毒素污染[J].中國蜂業, 2012, 63(7): 57.

[5]方文富. 12種有毒蜜粉源植物及預防中毒措施[J].中國蜂業, 2007, 58(2): 28-29.

[6] NIHAL A B, TELAT K, TAHIR D, et al. A rare cause of atrial fibrillation: mad honey intoxication[J]. The Journal of Emergency Medicine, 2012, 43(6): 389-391.

[7]荊戰星.重慶秀山蜂蜜中毒事件[J].中國蜂業, 2011, 62(11): 43.

[8] JAUHARI A C, JOHOREY A C, BANERJEE I, et al. Nearly fatal wild honey intoxication a case report of seven cases[J]. Journal of Clinical and Diagnostic Research, 2009, 3: 1685-1689.

[9] RAMIREZ M, RIVERA E, EREU C.Fifteen cases of atropine poisoning after honey ingestion[J].Vet Hum Toxicol, 1999, 41(1): 19-20.

[10]閆繼紅.蜂產品深加工與配方技術[M].北京:中國農業科學技術出版社, 2005: 65.

[11]郭艷紅,譚墾,宋啟示. HPLC法測定昆明山海棠蜜中雷公藤甲素的含量[J].云南農業大學學報, 2007, 22(3): 401-403.

[12]金米聰,馬建明,姚潯平,等.全血中痕量雷公藤紅素的液相色譜/質譜聯用法測定研究[J].中國衛生檢驗雜志, 2008 , 18(7): 1242-1244.

[13]陳曉紅,歐陽小琨,金米聰.固相萃取純化-高效液相色譜-串聯質譜法測定尿液中痕量雷公藤紅素[J].理化檢驗:化學分冊, 2010, 46(8): 948-951.

[14]薛云云,瑪爾江·巴哈·提別克,王彥,等.大鼠血漿中雷公藤紅素的HPLC法測定[J].中國醫藥工業雜志, 2011, 42(7): 532-535.

[15]陳列忠,王開金,陳建明,等. RP-HPLC法同時測定不同產地雷公藤根皮中3種生物堿的含量[J].藥物分析雜志, 2007, 27(2): 191-193.

[17]吳斌,徐錦忠,陳惠蘭,等. GB/T 23408—2009蜂蜜中大環內酯類藥物殘留量測定:液相色譜-質譜/質譜法[S].北京:中國標準出版社, 2009.

[18]王菲,李彤,馬辰.超高效液相色譜-串聯質譜法測定中藥材中三唑類殺菌劑及三嗪類除草劑的殘留量[J].色譜, 2013, 31(3): 191-199.

[19]鮑曉霞,喬東,章曉氡,等. GB/T 27404—2008實驗室質量控制規范:食品理化檢測[S].北京:中國標準出版社, 2008.

Determination of Triptolide and Wilforine in Honey by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LEI Meikang1, PENG Fang1, ZHU Zitong1, DING Tao2, XU Jiawen1, WU Xiaoqin1
(1. Technology Center of Quzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Quzhou 324002, China; 2. Laboratory of Food, Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001, China)

A method based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS-MS) has been proposed for the determination of triptolide and wilforine residues in honey. The samples were dissolved in water and extracted with acetonitril, separated on a Hypersil GOLD C18column (50 mm×2.1 mm, 1.9μm) with gradient elution. The determination was carried out with electrospray ion source under the positive mode and multiple reaction monitoring (SRM) mode. The concentrations of triptolide and wilforine in the range of 0.01-20 ng/mL were linearly correlated to the peak area, with correlation coefficients greater than 0.997. The limits of quantification (RSN＞ 10）for both triptolide and wilforine were 0.05μg/kg. The recoveries of triptolide and wilforine were 69.9%-101.5%, respectively, at spiked concentrations of 0.05μg/kg and 1.0μg/kg, with relative standard deviations (RSD,n= 6) lower than 10%. Our results indicate that the developed method is rapid, sensitive and accurate for the qualitative and quantitative analysis of triptolide and wilforine in honey.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; honey; triptolide; wilforine

S896.8

A

1002-6630（2015）12-0218-03

10.7506/spkx1002-6630-201512041

2014-10-10

浙江省公益性技術應用研究計劃項目（2013C37101）

雷美康（1982—），男，工程師，碩士，研究方向為分析檢測及標準化。E-mail：leimeikang@163.com