免疫磁珠捕獲PCR快速檢測單核細胞增生李斯特氏菌

李婧姮，郭慧琴，高曉強，劉 芳，邱 實，李建武，曾海娟，劉 蘭，宋春美，劉 箐,*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海慧耘生物科技有限公司，上海 200433；3.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅 蘭州 730020）

免疫磁珠捕獲PCR快速檢測單核細胞增生李斯特氏菌

李婧姮1，郭慧琴2，高曉強3，劉 芳3，邱 實1，李建武1，曾海娟1，劉 蘭2，宋春美1，劉 箐1,*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.上海慧耘生物科技有限公司，上海 200433；3.甘肅出入境檢驗檢疫局，甘肅 蘭州 730020）

利用免疫磁珠富集單核細胞增生李斯特氏菌，采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增進行快速檢測。所制備的免疫磁珠選取在37 ℃條件下均勻振蕩1 h為最佳包被條件，1 mg磁珠偶聯抗體的最佳量為100 μg/mg，制備的免疫磁珠捕獲率為45%。所建立的免疫磁珠捕獲-PCR技術在樣品細菌濃度達到104CFU/mL即可被檢出，其靈敏度是直接PCR檢測限（105CFU/mL）的10 倍，可為病原菌的富集和快速檢測提供新方法。

免疫磁珠；單核細胞增生李斯特氏菌；聚合酶鏈式反應

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一種常見的食源性致病菌，世界貿易組織于20世紀90年代將其列為四大食源性病原菌之一。由于其廣泛存在于自然界，當牲畜感染后，最終可通過食物鏈導致人類感染。人類受感染后可導致腦膜炎、胃腸炎、敗血癥、孕婦流產等，新生兒及免疫力低下者更易感染。由于該菌能忍受冷凍和干燥，在極端的環境中亦能存活，因此對人體的身體健康造成潛在的危險[1-2]。

目前針對于Lm的檢測方法有傳統分離檢測法、酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、酶免疫分析檢測技術等[3-4]。上述方法中，增菌培養是重要步驟但耗時長，ELISA方法由于單克隆抗體費用昂貴，所以用ELISA盒進行多種食品樣品的檢測費用較高[5]。因此，建立一種快速的樣品前處理方法顯得尤為重要。免疫磁珠富集技術是以磁性微球通過結合特定抗體，加到待測樣品中與相應抗原結合，再依靠磁場作用力使所需樣品在短時間內得以大量濃縮的技術手段[6]。由于免疫磁珠富集技術具有快速及特異性強的特點，目前已廣泛應用于分離及濃縮特定微生物、蛋白質等微量有害物質[7-10]。

本研究運用免疫Lm的多克隆抗體與磁珠進行偶聯制備免疫磁珠，探討磁珠與抗體最佳偶聯條件，結合免疫磁珠富集技術與選擇性平板培養法，初步建立免疫磁珠-選擇性平板快速檢測方案，對Lm進行分離及鑒定，以實現對Lm進行快速檢測[11]。同時，利用免疫磁珠富集技術進行病原富集并聯合聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術，建立一種快速檢測Lm的新方法。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑與儀器

Lm菌株（ATCC 43251） 上?；墼派锟萍加邢薰尽?/p>

羧基磁珠（直徑0.5 μm） 鄭州英諾生物科技有限公司；Lm多克隆抗體 上海慧耘生物科技有限公司；腦心浸液培養基 北京陸橋技術有限公司；考馬斯亮藍蛋白試劑盒、2-（N-嗎啉）乙磺酸（2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid，MES）、碳二亞胺（carbodiimide，EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、Taq DNA聚合酶及其他PCR試劑、本實驗所用引物根據文獻[12]報道，其核苷酸序列為：hly1：CGGAGGTTCCGCAAAAGATG；hly2：CCTCCAGAGTGATCGATGTT，試劑及引物合成均為生工生物工程（上海）股份有限公司。

P C R熱循環儀 美國應用生物系統公司；SpectraMax M2多功能酶標儀 美國分子儀器公司；Mini-power電泳儀 美國伯樂公司；全系列離心機德國Eppendorf公司；磁分離架 鄭州英諾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 羧基磁珠與抗體偶聯條件優化

1.2.1.1 磁珠的活化

小瓶搖勻后移取200 μL羧基磁珠至1.5 mL離心管中，用200 μL的去離子水和MES（pH 6.0、0.05 mol/L）各洗2 次，然后用0.05 mol/L MES溶液配制100 mg/mL的EDC和NHS溶液，再分別加入100 μL EDC和NHS溶液到洗過的磁珠溶液中充分混合，并在室溫條件下振蕩45 min，振蕩結束，在磁力架上進行磁分離5 min并除去清液，用200 μL 0.05 mol/L MES溶液洗2 次，分散在100 μL 0.05 mol/L MES溶液中，4 ℃保存[13-14]。

1.2.1.2 磁珠與抗體最佳偶聯溫度

取200 μL活化后的磁珠重懸于各離心管中，加入等量的用偶聯的緩沖液稀釋的500 μL抗體之后經過[15]：1）4 ℃包被3 h；2）常溫條件下包被3 h；3）37 ℃包被3 h，每個溫度設定3 個平行。然后在磁力架上磁分離5 min后，吸取上清液于另一離心管中，用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒在595 nm波長處測得OD值，以確定磁珠與抗體最佳偶聯溫度[16]。

1.2.1.3 磁珠與抗體最佳偶聯時間

取200 μL活化后的磁珠重懸于各離心管中，分別加入等量的用偶聯的緩沖液稀釋的300 μL抗體，在37 ℃條件下分別偶聯0.5、1、2、3、4、6 h，保持磁珠處于均勻懸浮狀態，每個時間設定3 個平行。用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒測定OD值，以確定磁珠與抗體的最佳偶聯時間[17]。

1.2.1.4 羧基磁珠與抗體最佳偶聯率

取等量1 mg活化后的磁珠，分別加入40、60、80、100、200、400、600、800、1 000 μg的抗體，每組設定3 個平行。在37 ℃條件下包被1 h后，磁分離取上清溶液，用考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒測定OD值，以確定磁珠與抗體最佳偶聯率[18]。

1.2.2 免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMBs）的制備

取200 μL磁珠加入到300 μL抗體中，室溫條件下振蕩1 h，振蕩結束后磁分離5 min并去除上清液，并用含有2%牛血清白蛋白的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）室溫封閉1 h，封閉結束用PBS洗3 次，然后分散在200 mL PBS中，保存于4 ℃備用[19]。

1.2.3IMBs捕獲率的確定

用接菌環挑去Lm單菌落接種于滅菌腦心浸液液體培養基中，37 ℃搖床過夜。用無菌生理鹽水10 倍稀釋Lm菌液到104。取兩份樣品，均為100 μL，一份直接涂布于顯色培養基上，另一份加到1.5 mL離心管中，加入20 μL免疫磁珠，然后在37 ℃條件下孵育1 h，使免疫磁珠處于均勻混合的狀態。然后磁分離5 min，棄上清液后用PBS洗3 次，懸浮在20 μL PBS中，再涂布于顯色培養基上，置于37 ℃恒溫箱培育20 h，觀察并統計平板上的菌落數。

1.2.4 PCR檢測

取10 倍稀釋好的各濃度菌液100 μL，分別加入20 μL免疫磁珠，然后在37 ℃條件下孵育1 h，使免疫磁珠處于均勻混合的狀態[20]。然后磁分離5 min，吸走上清后用PBS洗3 次，重懸在20 μL PBS中，75 ℃裂解30 min后，Lm裂解后DNA會釋放出來，15 000 r/min離心15 min，使磁珠完全沉在PCR管底部，取上清液5 μL作模板[21-22]。將IMBs捕獲的細菌進行PCR檢測，PCR反應體系為：含Mg2+的Buffer（10×）5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）2 μL，Taq DNA Polymerase（5 U/μL）0.5 μL，正負引物（10 pmol/μL）3 μL，模板5 μL，用去離子水補充至50 μL。PCR擴增條件為變性95 ℃、20 min，95 ℃、30 s，退火55 ℃、45 s，延伸72 ℃、45 s，35 個循環，72 ℃、5 min，4 ℃保存[23]，并與直接PCR作比較。

2 結果與分析

2.1 羧基磁珠與抗體偶聯條件優化

2.1.1 偶聯溫度優化

活化磁珠在不同溫度條件下與抗體偶聯，用考馬斯亮藍蛋白試劑盒測得上清中剩余抗體的含量，3 次平行結果如表1所示。4 ℃時磁珠與抗體偶聯量為0.218 mg/mL，隨著溫度的升高，磁珠偶聯抗體的量也在不斷增加。常溫時磁珠與抗體偶聯量為0.387 mg/mL，37 ℃時磁珠偶聯抗體量為0.391 mg/mL，此時磁珠偶聯抗體量趨于飽和，故選擇37 ℃為最佳偶聯溫度。

表1 不同溫度條件下磁珠與抗體偶聯量Table 1 The concentrations of antibody conjugated to immunomagnetic beads at different temperatures mg/mL

2.1.2 偶聯時間優化

活化磁珠與抗體在不同時間內偶聯，用考馬斯亮藍蛋白試劑盒測得上清中剩余抗體的OD值，結果如圖1所示。當偶聯時間在0.5～1 h，上清液的OD值快速遞減，磁珠和抗體大量偶聯，當偶聯時間大于1 h，上清液的OD值趨于平緩，磁珠偶聯抗體已達到飽和。故選擇1 h為最佳偶聯時間。

圖1 時間對偶聯效果的影響Fig.1 Time course of conjugation between antibody and immunomagnetic beads

2.1.3 羧基磁珠與抗體偶聯率優化

圖2 加入抗體量對偶聯效果的影響Fig.2 Effect of antibody concentration on the conjugation to immunemagnetic beads

用1 mg的活化磁珠與不同質量的抗體在相同條件下偶聯，用考馬斯亮藍蛋白試劑盒測得上清液中剩余抗體含量，結果如圖2所示。當加入抗體量在40～100 μg時，磁珠偶聯抗體的量隨加入抗體量的增加而增加，當加入抗體量大于100 μg時，磁珠偶聯抗體的量趨于飽和，因此1 mg羧基磁珠偶聯抗體最佳用量為100 μg。

2.2 免疫磁珠捕獲率

根據平板計數，原Lm菌液濃度為2.2×108CFU/mL，IMBs與稀釋到104的Lm菌結合后，觀察其在顯色平板上的生長情況。如圖3所示，A平板是IMBs捕獲100 μL 104CFU /mL Lm菌在顯色平板上的生長情況，B平板是是100 μL 104CFU/mL Lm菌在顯色平板上的生長情況。圖3A顯色平板上紅色圓環圈住的藍綠色小點為Lm菌，中間連成片的棕色區域為免疫磁珠（顏色圖中未顯示），IMBs對Lm菌的捕獲率約為45%，說明IMBs對Lm菌體有良好的捕捉能力。

圖3 IMBs LLmm在顯色平板中的生長情況Fig.3 Growth status ofLmcaptured by IMBs in chromogenic medium

2.3 IMBs捕獲Lm-PCR檢測結果

圖4 IMBs-PCR和Direct-PCR捕菌效果比較Fig.4 Comparison of bacterial capture efficiency between IMBs-PCR and direct PCR

由圖4可知，6～9號泳道分別是濃度為108～105CFU/mL的Lm菌液做直接PCR擴增后的目標條帶，直接PCR最低檢測限為105CFU/mL。1～5號泳道分別是濃度為104～108CFU/mL的Lm菌液用IMBs捕獲后再做PCR擴增后的目標條帶，由此可知IMBs-PCR捕捉Lm最低檢測限可達到104CFU/mL，即所取的1 μL模板中只要有10 CFU Lm細菌就能被檢測出來，靈敏度是原來的10 倍，由此證明用IMBs富集Lm可有效提高PCR檢測的靈敏度。

3 結 論

本實驗證明了磁珠與抗體的偶聯時間和偶聯溫度均會對磁珠偶聯抗體的含量產生極大影響，在實驗中還發現，偶聯溫度過低不利于磁珠與抗體的結合，低溫條件下磁珠容易發生凝聚，抗體活性也比較低，在37 ℃時偶聯效果最好[18]。制備的免疫磁珠選取37 ℃條件下均勻振蕩1 h為最佳包被條件，1 mg磁珠偶聯抗體的最佳量為100 μg，制備出的IMBs捕獲率為45%。用IMBs富集Lm有效降低PCR對Lm的最低檢測限，樣品中只要有10 CFU /mL就能被檢測出來，整個檢測時間在7 h，與傳統檢測方法相比縮短了10～12 h[23-24]。

免疫磁珠雖廣泛，但仍存在一些問題，要想獲得大小均勻、粒度適中的磁珠，其制備難度較大[8]。目前市場上的磁珠價格也比較昂貴，大大限制了免疫磁珠的推廣及應用。市場上由于單克隆抗體費用昂貴，目前制備IMBs多使用多克隆抗體，但由于靶細胞表面有多個抗原決定簇，想要用IMBs分離到純的細胞也比較困難，用不同基團的磁珠制備IMBs結合靶細胞雖可提高細胞分離率，但特異性受到影響[25]。隨著科技的發展，相信目前的問題都能解決，免疫磁珠將會得到更多的推廣和運用。

[1] 丁建英, 韓劍眾. 食品中單增李斯特菌的存在現狀及檢測方法研究進展[J]. 食品研究與開發, 2008, 29(12): 171-174.

[2] 張加林, 楊林嫻. 單增李斯特菌的食源性污染狀況及檢測方法[J].醫學理論與實踐, 2012(8): 910-911.

[3] 段霞, 黃欣, 黃嶺芳, 等. 雙抗夾心ELISA方法檢測食品中單核細胞增生李斯特氏菌[J]. 食品科學, 2010, 31(24): 272-276.

[4] 張亞爽. LAMP和PCR檢測單核細胞增生性李斯特氏菌的研究[D].保定: 河北農業大學, 2008: 4; 57.

[5] 郭桂萍, 葛紅梅, 王勻, 等. 單增李斯特菌檢測技術研究進展[J]. 中國食物與營養, 2011, 17(3): 12-15.

[6] 何小曼, 曾繁啟. 免疫磁珠分離技術在微生物學檢測中的應用[J].中國生物制品學雜志, 2008(11): 1030-1032.

[7] 閆冰, 李一松, 霍貴成, 等. 食品中單核細胞增多李斯特菌的快速檢測[J]. 食品工業科技, 2006, 27(10): 202-205.

[8] 張璇, 鮮瑤. 免疫磁珠技術及其在食品微生物檢測中的應用[J]. 農產品質量與安全, 2011(1): 40-43.

[9] 楊金玲, 陳翊平, 鄒明強, 等. 超順納米磁顆粒在生化分離分析中的研究進展[J]. 分析測試學報, 2013(10): 1270-1276.

[10] 黃小林, 許恒毅, 熊勇華, 等. 磁性納米材料在食源性致病菌分離中應用的研究進展[J]. 食品科學, 2014, 35(11): 280-285. doi: 10.7506/ spkx1002-6630-201411056.

[11] 劉雅莉, 劉箐, 劉芳, 等. 免疫捕捉PCR和直接PCR技術檢測單核細胞增生性李斯特菌比較研究[J]. 食品科學, 2012, 33(20): 243-248.

[12] 王海艷, 劉中學, 劉虹, 等. 食品中單增李斯特菌快速、敏感、特異PCR檢測方法的建立[J]. 檢驗檢疫科學, 2006, 16(1): 3-6.

[13] 劉輝榮, 徐宏, 古宏晨, 等. 簡便高效分離細胞新型免疫磁珠制備[J].中國公共衛生, 2008, 24(11): 1349-1351.

[14] 王海明, 俞曉, 金燕飛, 等. 應用磁免疫技術快速檢測食源性沙門氏菌方法研究[J]. 中國衛生監督雜志, 2009(1): 36-39.

[15] 王曉聞, 楊永莉. 免疫磁珠捕獲-PCR檢測牛乳中沙門氏菌的研究[J]. 山西農業大學學報: 自然科學版, 2009(4): 289-293.

[16] 王東升, 張巖, 呂平, 等. 抗體包被免疫磁珠的研制及其應用[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2001(3): 296-297.

[17] 鐘子清, 熊勇華, 賴衛華, 等. 納米免疫磁珠富集單核增生李斯特菌[J]. 食品科學, 2013, 24(23): 212-215. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201323044.

[18] 徐金亭, 李志清, 向軍儉, 等. 單增李斯特菌免疫磁珠的制備研究[J].食品工業科技, 2012, 33(5): 323-327.

[19] 劉燕艷. 免疫磁珠-實時熒光PCR聯用技術快速檢測食品中單增李斯特菌的研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2014.

[20] 馮家望, 吳小倫, 黃云君, 等. 食品中單核增生性李斯特菌的PCR快速檢測研究[J]. 中國食品衛生雜志, 2005(3): 234-237.

[21] 張輝, 崔煥忠, 何昭陽. 應用PCR檢測單核細胞增生性李斯特氏菌[J].中國獸醫雜志, 2007(9): 76-77.

[22] 徐偉, 劉軍, 李素芳. 單增李斯特菌與志賀氏菌多重PCR檢測技術的建立[J]. 中國食品學報, 2009, 9(1): 201-207.

[23] 聞一鳴. 應用特異性免疫磁珠快速檢測單增李斯特菌[D]. 廣州: 暨南大學, 2013.

[24] 王海艷, 劉中學, 劉虹, 等. 食品中單增李斯特菌快速、敏感、特異PCR檢測方法的建立[J]. 檢驗檢疫科學, 2006(1): 3-6.

[25] 于露, 孫秀蘭. 免疫磁珠技術研究進展[J]. 糧食與油脂, 2011(10): 17-19.

Immunomagnetic Capture PCR for Rapid Detection of Listeria monocytogenes

LI Jingheng1, GUO Huiqin2, GAO Xiaoqiang3, LIU Fang3, QIU Shi1, LI Jianwu1, ZENG Haijuan1, LIU Lan2, SONG Chunmei1, LIU Qing1,*
(1. College of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. Prajna Biology Technique Co. Ltd., Shanghai 200433, China; 3. Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 730020, China)

This experiment was conducted using immunomagnetic enrichment followed by amplifi cation with polymerase chain reaction (PCR) for rapid detection of Listeria monocytogenes. The best coating conditions were achieved by shaking the prepared immunomagnetic beads at 37 ℃ for 1 h, and the amount of antibody conjugated to the immunomagnetic beads was 100 μg/mg, leading to a capture rate of 45%. The immunomagnetic capture PCR assay was able to detect as low as 104CFU/mL Listeria monocytogenes with 10 times higher sensitivity than direct PCR showing a limit of detection of 105CFU/mL. This PCR assay can provide a new method for the enrichment and rapid detection of pathogenic bacteria.

IMBs; Listeria monocytogenes; PCR

TS201.3

A

1002-6630（2015）12-0226-04

10.7506/spkx1002-6630-201512043

2014-10-15

上海理工大學大學生卓越工程項目；上海市科委重點支撐項目（13430502400）

李婧姮（1993—），女，本科生，研究方向為食品微生物。E-mail：jinghengl116@126.com

*通信作者：劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌致病機理及快速檢測技術。E-mail：liuq@usst.edu.cn