液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定果蔬中16 種新型酰胺類殺菌劑殘留量

（寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（寧波），浙江 寧波 315040）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定果蔬中16 種新型酰胺類殺菌劑殘留量

孫亞米，呂 燕，吳銀良*

（寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（寧波），浙江 寧波 315040）

建立果蔬（白菜、芹菜、草莓和葡萄）中16種新型酰胺類殺菌劑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速分析方法。樣品用乙腈提取和氯化鈉鹽析分層后，上清液直接用0.1%甲酸溶液稀釋10倍后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。采用Acquity BEH C18色譜柱分離，用0.1%甲酸溶液-乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，基質(zhì)校準(zhǔn)外標(biāo)法定量。各物質(zhì)峰面積與樣品質(zhì)量濃度在2.5×10-4～0.25 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸系數(shù)不低于0.994 9。在添加量0.01～5.0 mg/kg范圍內(nèi)，4種果蔬加標(biāo)16種殺菌劑的平均添加回收率在85.7%～103.9%范圍內(nèi)，批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.6%～5.2%之間。16種新型酰胺類殺菌劑的檢出限為1.0×10-4～3.0×10-3mg/kg，定量限為3.0×10-4～0.01 mg/kg。該方法能滿足果蔬中16種新型酰胺類殺菌劑殘留量分析的要求。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；酰胺類殺菌劑；果蔬；殘留量

酰胺類殺菌劑是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有酰胺結(jié)構(gòu)的一類殺菌劑。1966年由有利來路公司（現(xiàn)科聚亞公司）成功開發(fā)第一個酰胺類殺菌劑萎銹靈以來，該類化合物作為殺菌劑已有近50 a的歷史，其代表性品種有甲霜靈、惡霜靈和苯霜靈等[1]。近年來，由于殺菌、防霉效果突出，農(nóng)藥公司推出了一批新型的酰胺類殺菌劑，如噻唑菌胺、啶酰菌胺、氟吡菌胺和雙炔酰菌胺等。雖然該類藥物毒性較低，但為了保護(hù)公眾身體健康，我國最新頒布的GB 2763—2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定了苯酰菌胺、氰酰胺、啶酰菌胺、氟吡菌胺、環(huán)酰菌胺、噻呋酰胺、雙炔酰菌胺7種新型酰胺類殺菌劑在食品中的殘留限量，而目前尚未有同時分析這7種新型殺菌劑殘留分析方法的報道，因此建立果蔬中簡單準(zhǔn)確的新型酰胺類殺菌劑殘留量分析方法已是迫在眉睫。

目前，國內(nèi)外公開報道的關(guān)于新型酰胺類殺菌劑分析手段主要有免疫分析法[2-3]、氣相色譜法[4-7]、液相色譜法[8-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法[10-11]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-19]，其中目前報道較多的分析方法為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法。然而，這些報道的資料中涉及新型酰胺類殺菌劑通常不超過6種，如崔淑華等[16]建立了果蔬中4種新型酰胺類殺菌劑殘留LCMS-MS分析方法，陳小龍等[14]建立了果蔬中6種新型酰胺類殺菌劑的殘留量LC-MS-MS分析方法；而同時能分析超過6種新型殺菌劑的分析方法僅見王云鳳等[15]建立了的果蔬中10種新型酰胺類殺菌劑LC-MS方法；可目前這些方法均不能同時測定GB 2763—2014規(guī)定的7種新型殺菌劑殘留量。為滿足樣品實際測定需要，本研究考慮到LC-MS-MS分析方法具有較好的選擇性[20-25]，建立了能同時分析16種新型酰胺類殺菌劑的LC-MS-MS分析方法；同時考慮到7種新型酰胺類殺菌劑限量（0.01～30 mg/kg）較高以及LC-MS-MS對酰胺類殺菌劑分析的高靈敏性和選擇性，本研究所建立的方法中前處理非常簡單，僅通過乙腈提取后進(jìn)行稀釋即可進(jìn)樣分析。最后通過方法學(xué)考察，該方法適用于果蔬中16種新型酰胺類殺菌劑殘留量分析需要。

1 材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

白菜、芹菜、草莓和葡萄 市售。

硫硅菌胺、環(huán)丙酰亞胺、啶酰菌胺、氰菌胺、環(huán)氟酰菌胺、呋吡菌胺、苯酰菌胺、環(huán)酰菌胺、氟吡菌胺、雙炔酰菌胺、噻唑菌胺、噻酰菌胺、氟吡菌酰胺、噻氟菌胺、聯(lián)苯吡菌胺和吡噻菌胺標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈和甲醇均為色譜純 美國Fisher公司；甲酸（色譜純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司。

Acquity UPLC XevoTMTQ MS液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配置電噴霧離子源） 美國Waters公司；3k15型離心機(jī) 德國Sigma公司；Ultra-Tyrrax T25型勻質(zhì)器德國IKA公司。

1.2方法

1.2.1儀器條件

Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度洗脫條件：B相在0.5 min內(nèi)保持20%，然后在3.5 min內(nèi)線性增加到80%，保持1.5 min，然后在0.1 min內(nèi)降至20%，保持1.4 min；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 ?L；柱溫：35℃。

MS條件：電噴霧離子源正離子模式電離；多反應(yīng)監(jiān)測；毛細(xì)管電壓：2.0 kV；萃取錐孔電壓：20 V；RF透鏡電壓：0.5 V；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣溫度：500℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣流速：1 000 L/h；倍增器電壓：650 V；二級碰撞氣：氬氣；其他條件詳見表1。

表1 16 種新型酰胺類殺菌劑的定性、定量離子對、錐孔電壓及碰撞能量Table 1 Qualitative ion pairs, quantitative ion pairs, cone voltages and collision energy of 16 amide fungicides

1.2.2樣品處理

準(zhǔn)確稱取5 g果樣品于帶蓋的聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL乙腈，高速勻漿1 min后加2 g氯化鈉，劇烈振搖1 min，以5 000 r/min離心3 min，吸取上層有機(jī)相0.1 mL與0.1 mL乙腈和0.8 mL 0.1%甲酸溶液混合均勻，過0.22μm濾膜后進(jìn)行LC-MS-MS分析。

1.2.3線性實驗

分別稱取10 mg硫硅菌胺等14種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（噻氟菌胺和噻唑菌胺除外）于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度配制成1 000μg/mL的儲備液。吸取該標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1 mL于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋定容得到10 ?g/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。吸取0.5 mL噻氟菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 ?g/mL）氮氣緩慢吹干后加入0.50 mL噻唑菌胺標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 ?g/mL）和上述0.5 mL 14種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液混合均勻，即成5 mg/L 16種新型酰胺類殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。吸取適量該標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與0.1%甲酸溶液稀釋成2.5×10-4、1×10-3、2.5×10-3、0.01、0.025、0.10、0.25 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行LC-MS-MS分析，每一質(zhì)量濃度進(jìn)樣3次，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)的定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液線性實驗

樣品經(jīng)1.2.2節(jié)進(jìn)行提取后，吸取不同體積上清液（200、100、50、25μL）與20μL乙腈配制的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液（2.5×10-3、0.01、0.025、0.10、0.25、1.0、2.5 mg/L）、適量乙腈和0.1%甲酸溶液混合均勻，使除吸取200μL上清液配制的溶液外其余2 mL最終溶液中乙腈與水體積比為80∶20，混合溶液過0.22μm濾膜后進(jìn)行LC-MS-MS分析。以各基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)的定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，繪制各物質(zhì)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5添加回收率實驗

本研究進(jìn)行果蔬樣品的添加回收率實驗，樣品處理同1.2.2節(jié)方法，樣品中16種新型酰胺類殺菌劑的添加量分別為0.01、0.05、0.5、5.0 mg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1儀器條件的建立

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，16種新型酰胺類殺菌劑在反相色譜柱上均有較強(qiáng)的保留，當(dāng)采用等度洗脫時，為使16種新型酰胺類殺菌劑均能洗脫，流動相中有機(jī)相比例較高，導(dǎo)致共流出雜質(zhì)較多，基質(zhì)效應(yīng)較強(qiáng)。因此，本實驗采用梯度洗脫的方式進(jìn)行實驗，同時經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相時，同一梯度條件下各物質(zhì)保留時間均比甲醇-0.1%甲酸溶液為流動相對較短，總離子流圖見圖1；同時經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)兩種流動相條件下基質(zhì)效應(yīng)和分離度均沒有明顯差異。為了既降低基質(zhì)效應(yīng)，又盡快完成色譜分析，本研究選擇乙腈-0.1%甲酸溶液體系進(jìn)行梯度洗脫。進(jìn)行梯度優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，氟吡菌胺、氟吡菌酰胺和噻酰菌胺三者色譜分離較困難，同時硫硅菌胺、氰菌胺、環(huán)丙酰亞胺和吡噻菌胺四者色譜分離也較困難，但LC-MS-MS能通過選擇離子對進(jìn)行監(jiān)測，所以本方法未能對它們進(jìn)行完全色譜分離，最終優(yōu)化后的色譜條件詳見1.2.1節(jié)方法。

酰胺類殺菌劑含有酰胺基團(tuán)，在酸性條件下較易質(zhì)子化，本研究利用Intellistart軟件對16種新型酰胺類殺菌劑在電噴霧正離子模式下進(jìn)行了參數(shù)選擇和優(yōu)化，得到的定性定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量詳見表1。同時為了提高分析靈敏度，方法中時間窗口分成了4段，分析時進(jìn)行分段掃描。在上述LC-MS-MS條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品和添加樣品詳見圖1。從圖1可見，該類殺菌劑的峰形均較好，白菜和芹菜的空白樣品均未見有明顯的干擾峰。

圖1 酰胺類殺菌劑總離子流圖和定性離子對MRM色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of amide fungicides

2.2 前處理方法的建立

崔淑華等[16]研究表明，蔬菜和水果樣品用乙腈提取后，采用硫酸鎂和氯化鈉進(jìn)行鹽析，噻唑菌胺、苯噻菌胺、氟吡菌胺和雙炔酰菌胺4種新型酰胺類殺菌劑的回收率均較好。本研究采用5 g樣品，分別用10、15 mL和20 mL乙腈進(jìn)行一次提取時發(fā)現(xiàn)，僅采用氯化鈉進(jìn)行鹽析條件下所有16種新型酰胺類殺菌劑的提取回收率均超過90%。因此首先采用10 mL乙腈對樣品中的殺菌劑進(jìn)行提取，再用氯化鈉進(jìn)行鹽析，然后對鹽析后的提取液采用不同稀釋配比進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)研究。基質(zhì)效應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將提取液5倍稀釋使用時，16種酰胺類殺菌劑在白菜、芹菜、草莓和葡萄4種果蔬提取液中基質(zhì)效應(yīng)較小（基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比范圍在0.8～1.2的分別有11、10、12種和14種。而當(dāng)提取液采用10倍及以上比例（20倍和40倍）稀釋時，除氟吡菌胺外（10倍和20倍稀釋時，芹菜基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率之比分別為1.27和1.23）其余15種殺菌劑的基質(zhì)效應(yīng)均較小。為了兼顧方法靈敏度和降低基質(zhì)效應(yīng)，本研究最終采用提取液10倍稀釋進(jìn)行實驗。

2.3線性實驗結(jié)果

根據(jù)1.2.3節(jié)線性實驗結(jié)果，對16種新型酰胺類殺菌劑在0.25～250μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x，μg/L）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從表2可知，16種殺菌劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性均較好，相關(guān)系數(shù)（R2）均不低于0.994 9，說明本方法適用于16種新型酰胺類殺菌劑殘留量的定量分析。

表2 16 種酰胺類殺菌劑的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear standard curve equations with correlation coefficients for 16 amide fungicides by LC-MS-MS

2.4 方法的檢出限、回收率和精密度

按照實驗測定步驟，在4種果蔬空白樣品中添加16種酰胺類殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加實驗3次重復(fù)，按1.2.2節(jié)進(jìn)行樣品處理，測定加標(biāo)回收率，考察方法的準(zhǔn)確性和可靠性。其中葡萄回收率結(jié)果詳見表3，添加量為0.01～5.0 mg/kg時，16種殺菌劑的加標(biāo)回收率在87.6%～102.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.7%～4.4%之間，完全能夠滿足殘留分析要求。其余3種果蔬菜中16種酰胺類殺菌劑的加標(biāo)回收率也在85.7%～103.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.6%～5.2%之間。同時按定性離子對信噪比為3計算該方法對16種酰胺類殺菌劑的檢出限為1.0×10-4～3.0×10-3mg/kg。按定性離子對信噪比為10計算該方法對16種酰胺類殺菌劑的定量限為3.0×10-4～0.01 mg/kg。我國GB 2763—2014中規(guī)定了食品中7種新型酰胺類殺菌劑（雙炔酰菌胺、啶酰菌胺、氟吡菌胺、環(huán)酰菌胺、苯酰菌胺、噻呋酰胺和氰菌胺）的最高殘留限量分別為0.01～25、2～5、0.05～0.5、0.02～30、0.02～15、2～3 mg/kg和1.0 mg/kg，而本法的定量限僅為3.0×10-4～0.01 mg/kg，可見本方法完全能滿足實際樣品測定的需要。

表3 葡萄中16 種酰胺類殺菌劑的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Mean recoveries and relative standard deviation of 16 amide fungicides in grape

2.5 方法應(yīng)用

利用該方法在2014年對寧波市45個葡萄樣品中16種酰胺類殺菌劑進(jìn)行了殘留量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有4個樣品有啶酰菌胺，含量范圍為0.025～0.19 mg/kg，未檢出其余15種新型酰胺類殺菌劑。同時利用該方法檢測了2014年9月采自江蘇揚州的18個白菜樣品和江西南昌的10個芹菜樣品，其中白菜樣品未檢出16種酰胺類殺菌劑，芹菜樣品中有1個樣品檢出啶酰菌胺，含量為0.08 mg/kg，未檢出其余15種新型酰胺類殺菌劑。

3 結(jié) 論

本實驗建立了快速測定果蔬中16種新型酰胺類殺菌劑的多殘留LC-MS-MS分析方法。對勻質(zhì)后的樣品，用乙腈提取，再采用氯化鈉鹽析，經(jīng)鹽析后的提取液直接稀釋后進(jìn)行LC-MS-MS分析。對上述16種殺菌劑，本方法回收率在85.7%～103.9%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.6%～5.2%之間，方法檢出限在1.0×10-4～3.0×10-3mg/kg之間，定量限在3.0×10-4～0.01 mg/kg之間。該LC-MS-MS分析方法具有快速、靈敏和準(zhǔn)確的特點，完全能夠滿足現(xiàn)行農(nóng)產(chǎn)品中16種新型酰胺類殺菌劑殘留量的分析要求。

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Fast Simultaneous Determination of Sixteen Novel Amide Fungicides in Vegetables and Fruits by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Yami,LüYan, WU Yinliang*
(Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agricultural Products (Ningbo), Ministry of Agriculture, Ningbo Academy of Agricultural Sciences, Ningbo 315040, China)

A fast method was developed for simultaneously determining 16 novel amide fungicides in fruits and vegetables using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). Samples were extracted with acetonitrile and saltedout by sodium chloride to partition amide fungicides into the upper acetonitrile layer. The upper supernatant was then directly diluted with 0.1%formic acid solution before being analyzed by LC-MS-MS on an Acquity BEH C18column with a mixture of 0.10%formic acid solution (A) and acetonitrile (B) as the mobile phase under gradient elution conditions. The mass spectrometer was operated in the positive ion mode using multiple-reaction monitoring (MRM). The target analytes were quantified by matrix-matched external standard calibration. There was a good linear correlation with calibration coefficients all above 0.994 9 between the peak areas and concentrations of the amide fungicides in the range of 2.5×10-4to 0.25 mg/L. The average recoveries of the 16 compounds in cabbage, celery, strawberry and grape were 85.7%-103.9%, and the intra-assay relative standard deviations (RSDs) were between 2.6%and 5.2%. The limits of quantification (LOQs) of these fungicides varied from 3.0×10-4to 0.01 mg/kg. The proposed method was demonstrated to be suitable for the determination of the 16 amide fungicides in vegetables and fruits.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry; amide fungicides; fruit and vegetables; residue

TS207.3

A

1002-6630（2015）12-0230-07

10.7506/spkx1002-6630-201512044

2014-08-08

寧波市農(nóng)科教結(jié)合項目（2013NK33）；2014年國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目（2014FP11）

孫亞米（1963—），女，農(nóng)藝師，學(xué)士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留分析方法。E-mail：zhangsky001@tom.com

*通信作者：吳銀良（1975—），男，教授級高級工程師，博士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留分析方法。

E-mail：wupaddyfield@sina.com