膜醭畢赤酵母結(jié)合殺菌劑對(duì)柑橘果實(shí)采后病害的控制效果

馮吉睿，周雅涵，曾凱芳,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.新疆克拉瑪依市食品藥品監(jiān)督管理局食品安全監(jiān)督執(zhí)法支隊(duì)，新疆 克拉瑪依 834000）

膜醭畢赤酵母結(jié)合殺菌劑對(duì)柑橘果實(shí)采后病害的控制效果

馮吉睿1,2，周雅涵1，曾凱芳1,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.新疆克拉瑪依市食品藥品監(jiān)督管理局食品安全監(jiān)督執(zhí)法支隊(duì)，新疆 克拉瑪依 834000）

探究膜醭畢赤酵母與低劑量殺菌劑（多菌靈、甲基硫菌靈）結(jié)合使用對(duì)柑橘采后病害的防治效果。通過(guò)篩選能與膜醭畢赤酵母結(jié)合使用的殺菌劑，考察柑橘常見(jiàn)病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性，繼而在果實(shí)上驗(yàn)證結(jié)合處理對(duì)柑橘采后病害的防治效果。離體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，多菌靈和甲基硫菌靈對(duì)酵母生長(zhǎng)無(wú)抑制作用；柑橘青霉菌、綠霉菌和炭疽菌對(duì)兩種殺菌劑敏感性不同，但半數(shù)抑制濃度（EC50值）均小于建議劑量的1%。果實(shí)活體實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的多菌靈或甲基硫菌靈對(duì)柑橘果實(shí)青霉病、綠霉病的防治效果均好于膜醭畢赤酵母和低劑量殺菌劑單獨(dú)處理；但膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的甲基硫菌靈對(duì)夏橙果實(shí)接種炭疽病的防治效果不佳。同時(shí)，膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的多菌靈或甲基硫菌靈對(duì)夏橙果實(shí)自然發(fā)病率的控制呈增效作用，對(duì)錦橙果實(shí)自然發(fā)病率的控制呈疊加作用，兩種結(jié)合處理均能保證夏橙和錦橙的好果率。

膜醭畢赤酵母；殺菌劑；柑橘果實(shí)；采后病害

柑橘是世界第一大水果，世界140多個(gè)國(guó)家和地區(qū)都有種植。中國(guó)作為世界上最大的柑橘生產(chǎn)國(guó)，種植面積和年產(chǎn)量均居世界第一位[1]。與快速發(fā)展的柑橘種植業(yè)和加工業(yè)相比，柑橘采后貯藏技術(shù)發(fā)展相對(duì)緩慢。其中，侵染性病害包括青霉病、綠霉病、炭疽病、蒂腐病、酸腐病等是造成柑橘采后損失的主要原因。目前柑橘果實(shí)采后侵染性病害的控制主要依賴(lài)于化學(xué)殺菌劑，如多菌靈、甲基硫菌靈、噻菌靈、抑霉唑、咪鮮胺等。其中，噻菌靈和抑霉唑是全球用于減少果蔬采后腐爛的主要?dú)⒕鷦2]。隨著人們更加關(guān)注殺菌劑對(duì)環(huán)境和食品安全的影響，尋找更安全、更環(huán)保的方法控制采后病害以替代或減少殺菌劑用量顯得尤為重要[3-4]。伴隨生物防治技術(shù)的發(fā)展，利用拮抗酵母菌控制果蔬采后病害逐漸成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。然而，與傳統(tǒng)的化學(xué)殺菌劑相比，拮抗酵母菌單獨(dú)使用容易受環(huán)境、果實(shí)生理狀態(tài)等多種因素的影響，防治效果往往達(dá)不到要求[5]。研究表明，拮抗酵母菌復(fù)合殺菌劑或其他物質(zhì)使用，能在降低殺菌劑用量的同時(shí)，很好地控制果蔬采后病害的發(fā)生[6-9]。此外，酵母具有降解真菌毒素和降低殺菌劑殘留的功能[10-11]。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，膜醭畢赤酵母復(fù)合水楊酸、熱處理對(duì)柑橘果實(shí)采后青霉病和綠霉病有很好控制效果[12]。膜醭畢赤酵母和低劑量殺菌劑復(fù)合使用控制果蔬采后病害的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬篩選能與膜醭畢赤酵母結(jié)合使用的殺菌劑，研究膜醭畢赤酵母與殺菌劑結(jié)合處理對(duì)柑橘果實(shí)采后病害的控制效果，以期減少采后柑橘果實(shí)化學(xué)殺菌劑用量，提高果實(shí)的貯藏安全性。

1 材料與方法

1.1材料、微生物與試劑

夏橙（Citrus sinensisL.Osbeck cv. Olinda Valencia orange）采于重慶市墊江縣白馬鎮(zhèn)；錦橙（Citrus sinensisL.Osbeck cv. Jincheng 447#）采于重慶市渝北區(qū)統(tǒng)景鎮(zhèn)。供試柑橘果實(shí)于當(dāng)天運(yùn)回貯藏于7～10℃冷庫(kù)，挑選大小均一、無(wú)機(jī)械傷、成熟度基本一致的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料。

膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens） 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；青霉菌（Penicillium italicumWehmer.）、綠霉菌（Penicillium digitatumSacc.）和炭疽菌（Colletotrichum gloeosporidesPenz.）為本實(shí)驗(yàn)室自行分離和保藏的菌種。

多菌靈（50%可濕性粉劑） 江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司；甲基硫菌靈（70%可濕性粉劑）、代森鋅（65%可濕性粉劑） 深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司；抑霉唑（500 g/L乳油） 江蘇龍燈化學(xué)有限公司；咪鮮胺（250 g/L乳油） 美國(guó)FMC公司；咪鮮胺錳鹽（50%可濕性粉劑） 上海生農(nóng)生化制品有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；BS-4G振蕩培養(yǎng)箱 金壇市富華儀器有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PSX-280手提式高壓殺菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；XB.K.25血球計(jì)數(shù)板型 上海求精生化試劑有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；WH-2微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司；SL602N高精顯電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1酵母懸浮液的制作

膜醭畢赤酵母是用于釀造荔枝酒的酵母，酵母于4℃低溫條件下保存在NYDA培養(yǎng)基。培養(yǎng)程序?yàn)椋?）活化：在28℃條件下，酵母在NYDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h[13]；2）液體培養(yǎng)：用接種環(huán)將活化好的酵母接種到NYDB液體培養(yǎng)基中，在200 r/min、28℃條件下培養(yǎng)24 h；3）離心分離：在5 000 r/min、4℃條件下，離心10 min，并用無(wú)菌水洗滌2次，除去培養(yǎng)介質(zhì)；4）再懸浮及質(zhì)量濃度確定：離心后的酵母細(xì)胞用無(wú)菌水重新懸浮，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，使用時(shí)再用無(wú)菌水稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.3.2青霉菌、綠霉菌和炭疽菌的培養(yǎng)

青霉菌和綠霉菌在PDA培養(yǎng)基于28℃條件下培養(yǎng)5 d，炭疽菌在PDA培養(yǎng)基于25℃條件下培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌打孔器取直徑為6 mm的菌塊用于實(shí)驗(yàn)。得到的青霉菌、綠霉菌在PDA培養(yǎng)基上于28℃條件下培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌水將孢子洗下，4層紗布過(guò)濾后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再用無(wú)菌水稀釋至所需數(shù)量濃度。炭疽菌在PDA培養(yǎng)基于25℃條件下培養(yǎng)，待長(zhǎng)出紅色孢子后用無(wú)菌水將孢子洗下，4層紗布過(guò)濾后，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，再用無(wú)菌水稀釋至所需數(shù)量濃度。青霉菌、綠霉菌孢子懸浮液數(shù)量濃度為1×104孢子/mL。炭疽菌孢子懸浮液數(shù)量濃度為1×105孢子/mL。

1.3.3膜醭畢赤酵母與殺菌劑的兼容性測(cè)定

分別稱(chēng)取一定量的多菌靈、甲基硫菌靈、抑霉唑、咪鮮胺、咪鮮胺錳鹽和代森鋅，用無(wú)菌水配制成一定質(zhì)量濃度的殺菌劑溶液，與滅菌冷卻至50℃左右的NYDA培養(yǎng)基（少加一定量水）混勻，配成含殺菌劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100%、75%、50%、25%的NYDA培養(yǎng)基（以商業(yè)建議劑量為100%，多菌靈、甲基硫菌靈、抑霉唑、咪鮮胺、咪鮮胺錳鹽和代森鋅的標(biāo)簽建議劑量分別是500、700、500、250、500μg/mL和650μg/mL），以不含殺菌劑的NYDA培養(yǎng)基做對(duì)照。倒平板，冷卻凝固后，接100μL104CFU/mL的酵母懸浮液涂布，在28℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察。每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)3個(gè)平板，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4病原菌對(duì)多菌靈和甲基硫菌靈的敏感性測(cè)定

將對(duì)酵母生長(zhǎng)沒(méi)有顯著抑制作用的殺菌劑（多菌靈和甲基硫菌靈）用無(wú)菌水稀釋10 000倍作為母液，取相應(yīng)量加入滅菌冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基中，混勻，配成最終質(zhì)量濃度為0.005、0.025、0.05、0.25、0.5μg/mL的含殺菌劑培養(yǎng)基，以不含殺菌劑的PDA培養(yǎng)基作對(duì)照。倒平板，冷卻凝固后，用滅菌的鑷子將培養(yǎng)5 d的青霉菌、綠霉菌和培養(yǎng)7 d的炭疽菌菌餅接種到上述系列殺菌劑質(zhì)量濃度的PDA培養(yǎng)基平板中央，青霉菌、綠霉菌在28℃培養(yǎng)4 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，炭疽菌在25℃培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落直徑，生長(zhǎng)抑制率計(jì)算如式（1）所示。以不同的殺菌劑質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（x），以殺菌劑對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)抑制率為縱坐標(biāo)（y）作圖，獲得回歸方程，計(jì)算殺菌劑對(duì)病原菌的半數(shù)抑制濃度（EC50），并按式（1）[14]計(jì)算抑制率。

1.3.5膜醭畢赤酵母結(jié)合殺菌劑對(duì)柑橘果實(shí)青霉、綠霉和炭疽病的防治效果

1.3.5.1接種病原菌后果實(shí)發(fā)病率測(cè)定

柑橘果實(shí)用2%次氯酸鈉溶液浸泡2 min進(jìn)行表面殺菌，然后用自來(lái)水沖洗，室溫條件下晾干。將果實(shí)隨機(jī)分成8組。用75%乙醇溶液擦拭果實(shí)赤道部位，用無(wú)菌打孔器在果實(shí)赤道部位對(duì)稱(chēng)打孔兩個(gè)（5 mm×3 mm），分別接種30μL1×104孢子/mL青霉菌、綠霉菌孢子懸浮液和1×105孢子/mL炭疽菌孢子懸浮液。接種后的果實(shí)在20℃、相對(duì)濕度為80%～90%環(huán)境中放置24 h后，分別在如下溶液中浸泡2 min：A：無(wú)菌水（對(duì)照）；B：1×108CFU/mL膜醭畢赤酵母；C：50μg/mL多菌靈（商業(yè)建議劑量的10%）；D：500μg/mL多菌靈（商業(yè)建議劑量）；E：50μg/mL多菌靈結(jié)合1×108CFU/mL膜醭畢赤酵母；F：70μg/mL甲基硫菌靈（商業(yè)建議劑量的10%）；G：700μg/mL甲基硫菌靈（商業(yè)建議劑量）；H：70μg/mL甲基硫菌靈結(jié)合1×108CFU/mL膜醭畢赤酵母。待果實(shí)晾干后單果包裝，置于（25±2）℃、相對(duì)濕度80%～90%條件下貯藏，觀察發(fā)病率。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6個(gè)果實(shí)。

1.3.5.2果實(shí)自然發(fā)病率測(cè)定

柑橘果實(shí)用2%次氯酸鈉浸泡2 min表面殺菌，然后用自來(lái)水沖洗，室溫條件下晾干。將果實(shí)隨機(jī)分成8組，分別在如下溶液中浸泡2 min：A：無(wú)菌水作為對(duì)照；B：1×108CFU/mL膜醭畢赤酵母；C：125μg/mL多菌靈（商業(yè)建議劑量的25%）；D：500μg/mL多菌靈（商業(yè)建議劑量）；E：125μg/mL多菌靈結(jié)合1×108CFU/mL膜醭畢赤酵母；F：175μg/mL甲基硫菌靈（商業(yè)建議劑量的25%）；G：700μg/mL甲基硫菌靈（商業(yè)建議劑量）；H：175μg/mL甲基硫菌靈結(jié)合1×108CFU/mL膜醭畢赤酵母。晾干后單果包裝，置于25℃條件下貯藏，每隔7 d調(diào)查發(fā)病率，計(jì)算方法如式（2）所示，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，計(jì)算協(xié)同作用因數(shù)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20個(gè)果實(shí)。

病情指數(shù)測(cè)定參照Hofman等[15]的方法，按病斑面積（V）進(jìn)行如下分級(jí)：0級(jí)：無(wú)病斑；1級(jí)：0＜V≤5%；2級(jí)：5%＜V≤15%；3級(jí)：15%＜V≤30%；4級(jí)：30%＜V≤50%；5級(jí)：V＞50%。計(jì)算如式（3）所示：

增效作用[9]：保護(hù)效力（protection efficacy，PE）取值范圍為0（沒(méi)有保護(hù)效力）～100（最大保護(hù)效力），計(jì)算如式（4）所示：

式（4）中：C為對(duì)照組果實(shí)發(fā)病個(gè)數(shù)；T為處理組（酵母菌、殺菌劑、酵母菌+殺菌劑）果實(shí)發(fā)病個(gè)數(shù)。

協(xié)同作用因數(shù)（synergy factor，SF）計(jì)算如式（5）所示：

式（5）中：E（obs）和E（exp）分別為實(shí)驗(yàn)觀察和期望得到的PE（酵母+殺菌劑）。

期望得到的PE值E（exp）計(jì)算如（6）所示：

式（6）中：a為酵母單獨(dú)使用的PE值；b為殺菌劑單獨(dú)使用的PE值。

如果SF=1，表明酵母和殺菌劑之間產(chǎn)生疊加作用；SF＞1，表明兩者之間產(chǎn)生協(xié)同作用；SF＜1，表明兩者之間產(chǎn)生拮抗作用。

1.4數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用Excel 2013統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤并制圖；應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），利用Duncan’s多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1膜醭畢赤酵母與殺菌劑的兼容性

表1 殺菌劑對(duì)膜醭畢赤酵母生長(zhǎng)的最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）Table 1 Minimum inhibitory concentration of fungicides toward the in vitro growth of the biocontrol yeast P. membranaefaciens

體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，多 菌靈（MIC＞500μg/mL）對(duì)膜醭畢赤酵母的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制作用，甲基硫菌靈在高質(zhì)量濃度時(shí)會(huì)影響膜醭畢赤酵母的生長(zhǎng)，在質(zhì)量濃度低于商業(yè)建議劑量的25%時(shí)（MIC＞175μg/mL）對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)沒(méi)有抑制。而抑霉唑、咪鮮胺、咪鮮胺錳鹽和代森鋅會(huì)強(qiáng)烈抑制膜醭畢赤酵母的生長(zhǎng)。故多菌靈和低質(zhì)量濃度的甲基硫菌靈（商業(yè)建議劑量的25%）可以和膜醭畢赤酵母結(jié)合來(lái)控制柑橘果實(shí)的采后侵染性病害。

2.2柑橘果實(shí)病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性

表2 多菌靈和甲基硫菌靈對(duì)青霉菌、綠霉菌和炭疽菌菌絲擴(kuò)展的影響Table 2 Effect of fungicides on the hyphal growth and development ofP. italicum P. digitatum and C. gloeosporioides

表2結(jié)果表明，青霉菌、綠霉病和炭疽病對(duì)多菌靈和甲基硫菌靈的敏感程度不同。甲基硫菌靈對(duì)青霉菌菌絲擴(kuò)展的EC50為2.571 0μg/mL，而多菌靈對(duì)青霉菌菌絲擴(kuò)展的EC50為0.026 8μg/mL，通過(guò)比較兩種殺菌劑對(duì)青霉菌菌絲擴(kuò)展的EC50得出，青霉菌對(duì)多菌靈更敏感，甲基硫菌靈次之。與青霉菌的結(jié)果相反，綠霉菌對(duì)甲基硫菌靈更敏感，多菌靈次之。與青霉菌的結(jié)果一致，炭疽菌對(duì)多菌靈更敏感，甲基硫菌靈次之。

2.3膜醭畢赤酵母結(jié)合殺菌劑對(duì)柑橘果實(shí)接種發(fā)病率的影響

表3 膜醭畢赤酵母結(jié)合殺菌劑對(duì)夏橙接種發(fā)病率的影響Table 3 Effect ofP. membranaefacienscombined with fungicides on the infection rate of Olinda Valencia orange%

表3結(jié)果表明，膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的多菌靈對(duì)夏橙接種青、綠霉病和炭疽病的防治效果均顯著好于對(duì)照組和酵母單獨(dú)處理組，與多菌靈單獨(dú)處理組無(wú)顯著性差異，但結(jié)合組的發(fā)病率低于低劑量單獨(dú)處理組。膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的甲基硫菌靈對(duì)夏橙接種青、綠霉病防治效果均顯著好于對(duì)照組和膜醭畢赤酵母單獨(dú)處理組，結(jié)合組的發(fā)病率與低劑量單獨(dú)處理組相當(dāng)并低于低劑量單獨(dú)處理組。結(jié)合處理對(duì)夏橙接種炭疽病的防治效果不佳。表4結(jié)果表明，膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的多菌靈對(duì)錦橙接種青、綠霉病和炭疽病的防治效果均顯著好于空白組和膜醭畢赤酵母單獨(dú)處理組，與多菌靈單獨(dú)處理組無(wú)顯著性差異，但結(jié)合組的發(fā)病率低于低劑量單獨(dú)處理組。膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的甲基硫菌靈對(duì)錦橙接種青、綠霉病和炭疽病的防治效果均顯著好于對(duì)照組和膜醭畢赤酵母單獨(dú)處理組，結(jié)合組的發(fā)病率與低劑量單獨(dú)處理組相當(dāng)并低于低劑量單獨(dú)處理組。

表4 膜醭畢赤酵母結(jié)合殺菌劑對(duì)錦橙接種發(fā)病率的影響Table 4 Effect of P. membranaefaciens combined with fungicides on the infection rate of Jincheng%

2.4膜醭畢赤酵母與殺菌劑結(jié)合對(duì)柑橘果實(shí)自然發(fā)病情況的影響

2.4.1膜醭畢赤酵母與殺菌劑結(jié)合對(duì)柑橘果實(shí)自 然發(fā)病率的影響

圖1 膜醭畢赤酵母結(jié)合殺菌劑對(duì)柑橘果實(shí)自然發(fā)病率的影響Fig.1 Effect of P. membranaefaciens in combination with fungicides on the disease incidence of citrus

如圖1a所示，在夏橙貯藏前28 d和貯藏第55天，膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量殺菌劑處理組的果實(shí)自然發(fā)病率均顯著低于對(duì)照組和酵母單獨(dú)處理組（P＜0.05）。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，膜醭畢赤酵母單獨(dú)處理和25%多菌靈處理對(duì)病害的控制效力下降。貯藏前21 d，結(jié)合處理組果實(shí)的自然發(fā)病率顯著低于與其他處理組。 貯藏28～55 d范圍內(nèi)，膜醭畢赤酵母結(jié)合25%多菌靈處理組果實(shí)的發(fā)病率與全劑量多菌靈處理組相當(dāng)并低于其他各組。而膜醭畢赤酵母結(jié)合25%甲基硫菌靈處理組果實(shí)發(fā)病率在貯藏第35、55天與25%甲基硫菌靈處理組沒(méi)有顯著性差異，前者低于后者。貯藏28 d之后，全劑量的甲基硫菌靈處理組果實(shí)發(fā)病率急劇上升，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。貯藏第55天，對(duì)照組的發(fā)病率達(dá)到100%，酵母組為96.30%，25%多菌靈組為94.44%，25%甲基硫菌靈組為88.89%，膜醭畢赤酵母結(jié)合25%多菌靈處理組為85.19%，膜醭畢赤酵母結(jié)合25%甲基硫菌靈處理組為85.19%。由圖1a可以得出，膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的多菌靈或甲基硫菌靈均可以很好地控制夏橙自然發(fā)病率。

如圖1b所示，在錦橙貯藏前56 d，膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量殺菌劑處理組的果實(shí)自然發(fā)病率均顯著低于對(duì)照組和膜醭畢赤酵母單獨(dú)處理組（P＜0.05），與殺菌劑單獨(dú)處理組的果實(shí)自然發(fā)病率沒(méi)有顯著性差異。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各個(gè)處理對(duì)病害的控制效力下降。貯藏第70天，結(jié)合處理組與低劑量殺菌劑處理組的果實(shí)自然發(fā)病率相當(dāng)并低于后者。貯藏第70天，膜醭畢赤酵母結(jié)合25%多菌靈的發(fā)病率比對(duì)照組低15.88%，比25%多菌靈單獨(dú)處理組低3.18%；膜醭畢赤酵母結(jié)合25%甲基硫菌靈的發(fā)病率比對(duì)照組低11.11%，比25%甲基硫菌靈單獨(dú)處理組低4.76%。由圖1b可以得出，膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的多菌靈或甲基硫菌靈均可以很好地控制錦橙自然發(fā)病率。

2.4.2膜醭畢赤酵母與殺菌劑結(jié)合對(duì)柑橘果實(shí)自然發(fā)病病情指數(shù)的影響

如圖2a所示，通過(guò)對(duì)膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量殺菌劑處理夏橙果實(shí)病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，病情指數(shù)表現(xiàn)出與自然發(fā)病率相似的結(jié)果。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各個(gè)處理組的病情指數(shù)逐漸上升。在整個(gè)貯藏期間，對(duì)照組的病情指數(shù)顯著高于膜醭畢赤酵母結(jié)合殺菌劑處理組，結(jié)合處理組的病情指數(shù)均小于其他處理組。在貯藏第55天，酵母結(jié)合低劑量多菌靈處理組的病情指數(shù)顯著低于多菌靈單獨(dú)處理組，酵母結(jié)合低劑量甲基硫菌靈處理組的病情指數(shù)與低劑量單獨(dú)處理組沒(méi)有顯著性差異。換言之，結(jié)合處理組不僅保證了低的自然發(fā)病率還保證了較小的病斑。

如圖2b所示，通過(guò)對(duì)膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量殺菌劑處理錦橙果實(shí)病情指數(shù)的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，病情指數(shù)表現(xiàn)出與自然發(fā)病率相似的結(jié)果。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各個(gè)處理組的病情指數(shù)逐漸上升。在整個(gè)貯藏期間，對(duì)照組和酵母單獨(dú)處理組的病情指數(shù)顯著高于酵母結(jié)合殺菌劑處理組。在貯藏第70天，酵母結(jié)合低劑量多菌靈處理組的病情指數(shù)顯著低于低劑量多菌靈單獨(dú)處理組，與全劑量多菌靈處理組無(wú)顯著性差異；酵母結(jié)合低劑量甲基硫菌靈處理組的病情指數(shù)顯著低于低劑量單獨(dú)處理組。換言之，結(jié)合處理組不僅保證了低的自然發(fā)病率還保證了較小的病斑。

圖2 膜醭畢赤酵母結(jié)合殺菌劑對(duì)柑橘自然發(fā)病病情指數(shù)的影響Fig.2 Effect ofP. membranaefaciensin combination with low doses of fungicides on the disease index of citrus

2.4.3協(xié)同作用因數(shù)

表5 不同殺菌劑和膜醭畢赤酵母結(jié)合使用的協(xié)同作用因數(shù)Table 5 Values of synergy factor forP. membranaefacienscombine with a low dose of different fungicides

通過(guò)對(duì)夏橙貯藏第14、28天和錦橙貯藏第28、70天的協(xié)同作用因數(shù)計(jì)算，以確定膜醭畢赤酵母和兩種殺菌劑是增效作用、疊加作用還是拮抗作用。在夏橙果實(shí)上多菌靈和甲基硫菌靈和酵母結(jié)合，兩者之間是增效作用。而在錦橙果實(shí)上，酵母和兩種殺菌劑之間是疊加作用。故多菌靈、甲基硫菌靈可以和膜醭畢赤酵母結(jié)合，用于柑橘病害的防治。

3 討論與結(jié)論

目前消費(fèi)者對(duì)柑橘果實(shí)安全性要求的提高和相關(guān)國(guó)家法律法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)果蔬農(nóng)殘要求的進(jìn)一步嚴(yán)格化[16]，迫使人們尋找控制柑橘采后病害的新措施以替代或減少化學(xué)殺菌劑的危害[17-18]。利用拮抗酵母來(lái)防治采后微生物病害被認(rèn)為是最有潛力的方法之一[19]。有研究表明，將拮抗酵母與其他天然物質(zhì)或低劑量的化學(xué)合成殺菌劑結(jié)合使用，能進(jìn)一步強(qiáng)化酵母對(duì)果實(shí)采后病害的控制效果。Lima等[9]將對(duì)殺菌劑有抗性的生防酵母（Rhodosporidium kratochvilovaeLS11和Cryptococcus laurentiiLS28）結(jié)合低劑量的啶酰菌胺或嘧菌環(huán)胺處理蘋(píng)果果實(shí)，不但能有效控制擴(kuò)展青霉對(duì)果實(shí)的侵染，減少果實(shí)表面殺菌劑的殘留量，而且降低了展青霉毒素對(duì)果實(shí)的污染，二者在病害控制上展現(xiàn)出協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，膜醭畢赤酵母復(fù)合低劑量多菌靈和甲基硫菌靈，對(duì)控制柑橘接種青霉病、綠霉病、炭疽病有很好的效果。同時(shí)在較長(zhǎng)的貯藏周期中，酵母復(fù)合低劑量多菌靈或甲基硫菌靈能顯著的抑制柑橘果實(shí)自然發(fā)病率及病情指數(shù)的上升。同時(shí)，增效因子的評(píng)價(jià)結(jié)果表明，酵母與低劑量的殺菌劑在夏橙采后病害控制上有明顯的增效作用。

增效和疊加作用的產(chǎn)生涉及果實(shí)、病原菌、酵母菌三者之間的相互作用[20-21]。對(duì)拮抗酵母菌來(lái)講，能快速在果實(shí)傷口定植、生長(zhǎng)和病原菌進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)其生防效力的發(fā)揮是至關(guān)重要的；殺菌劑對(duì)病原菌的生長(zhǎng)有直接的殺滅或抑制作用。體外實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，與酵母具有良好兼容性的殺菌劑對(duì)病原 菌菌絲生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。說(shuō)明低劑量殺菌劑通過(guò)對(duì)病原菌的抑制作用，強(qiáng)化了酵母的營(yíng)養(yǎng)和空間競(jìng)爭(zhēng)能力。膜醭畢赤酵母和低劑量的多菌靈或甲基硫菌靈復(fù)配使用，顯著降低了柑橘果實(shí)貯藏病害發(fā)生，一方面與兩種殺菌劑對(duì)病原菌的直接殺滅和抑制作用有關(guān)，另一方與膜醭畢赤酵母誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生的抗性有關(guān)。前期研究表明，膜醭畢赤酵母可以誘導(dǎo)柑橘果實(shí)的抗病性，延緩果實(shí)衰老[22]。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，苯并咪唑類(lèi)殺菌劑多菌靈和甲基硫菌靈在一定質(zhì)量濃度條件下不抑制膜醭畢赤酵母的生長(zhǎng)。柑橘侵染性病害病原菌青霉菌、綠霉菌和炭疽菌對(duì)以上兩種殺菌劑的敏感性很強(qiáng)。膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的多菌靈或甲基硫菌靈對(duì)柑橘接種青霉病、綠霉病的防治效果均好于酵母和低劑量殺菌劑單獨(dú)處理。膜醭畢赤酵母結(jié)合低劑量的甲基硫菌靈在夏橙上對(duì)接種炭疽病防治效果不佳。在自然發(fā)病率實(shí)驗(yàn)中，膜醭畢赤酵母和低劑量的多菌靈或甲基硫菌靈結(jié)合，呈現(xiàn)增效作用，能夠很好控制夏橙和錦橙采后侵染性病害的發(fā)生。

[1] FAO. Citrus is the first fruit tree-crop in terms of production with more than 128 MT per year[EB/OL]. [2014-12-01]. http://faostat.fao.org/.

[2] SCHIRRA M, D’AQUINO S, CABRAS P, et al. Control of postharvest diseases of fruit by heat and fungicides: efficacy, residue levels, and residue persistence. A review[J]. Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59: 8531-8542.

[3] SHARMA R R, SINGH D, SINGH R. Biological control of postharvest diseases of fruits and vegetables by microbial antagonists: a review[J]. Biological Control, 2009, 50: 205-221.

[4] SMILANICK J L, MANSOUR M F, MARGOSAN D A, et al. Influence of pH and NaHCO3on effectiveness of imazalil to inhibit germination ofPenicillium digitatumand to control postharvest green mold on citrus fruit[J]. Plant Disease, 2005, 89: 640-648.

[5] JANISIEWICZ W J, KORSTEN L. Biological control of postharvest diseases of fruits[J]. Annual Review of Phytopathology, 2002, 40: 411-441.

[6] LIMA G, SPINA A M, CASTORIA R, et al. Integration of biocontrol agents and food-grade additives for enhancing protection of apples fromPenicillium expansumduring storage[J]. Journal of Food Protection, 2005, 68: 2100-2106.

[7] LIMA G, de CURTIS F, de CICCO V. Interaction of microbial biocontrol agents and fungicides in the control of postharvest diseases[J]. Stewart Postharvest Review, 2008, 1: 1-7.

[8] DROBY S, WISNIEWSKI M, MACARISIN D, et al. Twenty years of postharvest biocontrol research: is it time for a new paradigm?[J]. Postharvest Biology and Technology, 2009, 52: 137-145.

[9] LIMA G, CASTORIA R, de CURTIS F, et al. Integrated control of blue mould using new fungicides and biocontrol yeasts lowers levels of fungicide residues and patulin contamination in apples[J]. Postharvest Biology and Technology, 2011, 60(2): 164-172.

[10] CASTORIA R, MORENA V, CAPUTO L, et al. Effect of the biocontrol yeastRhodotorula glutinisstrain LS11 on patulin accumulation in stored apples[J]. Phytopathology, 2005, 95(11): 1271-1278.

[11] CASTORIA R, MANNINA L, LUCIA M, et al. Nuovi dati sul decremento di patulina causato da un lievito di biocontrollo in mele infettate daPenicillium expansum[J]. Rapporti ISTISAN, 2007, 37: 147.

[12] ZHOU Yahan, MING Jian, DENG Lili, et al. Effect ofPichia membranaefaciensin combination with salicylic acid on postharvest blue and green mold decay in citrus fruits[J]. Biological Control, 2014, 74: 21-29.

[13]習(xí)柳,田世平.酵母拮抗菌與碳酸氫鈉配合對(duì)番茄果實(shí)采后病害的防治效果研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 38(5): 950-955.

[14] HOLMES G J, ECKERT J W. Sensitivity ofPenicillium digitatumandP. italicumto postharvest citrus fungicides in California[J]. Postharvest Pathology and Mycotoxins, 1999, 89(9): 716-721.

[15] HOFMAN P J, BEASLEY D R, JOYCE D C, et al. Bagging of mango (Mangifera indicacv.‘Keitt’) fruit influences fruit quality and mineral composition[J]. Postharvest Biology and Technology, 1997, 12(1): 83-91.

[16]馬強(qiáng),祁春節(jié).農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)中國(guó)大陸柑橘出口貿(mào)易影響的實(shí)證分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):社會(huì)科學(xué)版, 2013(6): 53-58.

[17] DROBY S, CHALUTZ E, WILSON C L, et al. Biological control of postharvest diseases: a promising alternative to the use of synthetic fungicides[J]. Phytoparasitica, 1992, 20(Suppl 1): 149-153.

[18] JANISIEWICZ W J, KORSTEN L. Biological control of postharvest diseases of fruits[J]. Annual Review of Phytopathology, 2002, 40(1): 411-441.

[19] SPADAROD, GULLINO M L. State of the art and future prospects of the biological control of postharvest fruit diseases[J]. International Journal of Food Microbiology, 2004, 91(2): 185-194.

[20] TEIXID? N, VI?AS I, USALL J, et al. Improving ecological fitness and environmental stress tolerance of the biocontrol yeast Candida sake by manipulation of intracellular sugar alcohol and sugar content[J]. Mycological Research, 1998, 102(11): 1409-1417.

[21] LIU J, WISNIEWSKI M, DROBY S, et al. Effect of heat shock treatment on stress tolerance and biocontrol efficacy ofMetschnikowia fructicola[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 76(1): 145-155.

[22] QING F, SHIPING T. Postharvest biological control ofRhizopusrot of nectarine fruits byPichia membranefaciens[J]. Plant Disease, 2000, 84(11): 1212-1216.

Combination ofPichia membranaefacienswith Fungicides for Control of Postharvest Diseases of Citrus Fruit

FENG Jirui1,2, ZHOU Yahan1, ZENG Kaifang1,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Food Safety Supervision and Law Enforcement Team of Food and Drug Administration Karamay Xinjiang, Karamay 834000, China)

In order to reduce the dosage of fungicides and find an effective control method for postharvest diseases of citrus, the effect ofPichia membranefaciensin combination with low-dose fungicides (carbendazim and thiophanate-methyl) on the control of postharvest citrus diseases was studied. Fungicides which could be well combined withP. membranaefacienswere selected and the sensitivity of common citrus pathogens to the selected fungicides was verified. The postharvest fruits were then used to validate the controlling effect ofP. membranefacienscombined with fungicides on their diseases. Thein vitroexperiments showed that neither carbendazim nor thiophanate-methyl inhibited the growth ofP. membranaefaciens. However,Penicillium italicum,Penicillium digitatumandColletotrichum gloeosporioidesshowed different sensitivities to the two fungicides, but the EC50values were all lower than 1%of the recommended dosage. Thein vivoexperiments showed that the treatment withP. membranefaciensin combination with either carbendazim or thiophanate-methyl had a better control efficacy on blue mold and green mold than the individual treatments. However, the anthracnose rot in Valencia orange was not well controlled byPichia membranefacienscombined with thiophanate-methyl. The combined treatments had a synergistic control effect on the incidence of Valencia orange diseases and an additive effect on that of Jincheng, which could be an effecti ve strategy to maintain good commercial rates of Valencia orange and Jincheng.

Pichia membranaefaciens; fungicide; citrus fruit;postharvest diseases

S609.3；S667.7

A

1002-6630（2015）12-0249-05

10.7506/spkx1002-6630-201512047

2014-12-23

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271958）；重慶市科技攻關(guān)（應(yīng)用技術(shù)研發(fā)類(lèi)/重點(diǎn)）項(xiàng)目（cstc2012gg-yyjsB80003）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201203034）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（XDJK2015D014）

馮吉睿（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸づc安全。E-mail：qishui93@163.com

*通信作者：曾凱芳（1972—），女，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：zengkaifang@163.com