油茶餅粕蛋白的制備及其酶解物活性分析

王 超 ，仲山民 ，朱俊朋 ，羅 凡 ，常銀子，鄭 劍 ，鄭旭衛

（1. 浙江農林大學 a.農業與食品科學學院；b.浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 臨安 311300；2.中國林業科學研究院 亞熱帶林業研究所，浙江 富陽 311400；3.浙江金華金山油脂有限公司，浙江 金華 321017）

油茶餅粕蛋白的制備及其酶解物活性分析

王 超1a,1b，仲山民1a,1b，朱俊朋1a,1b，羅 凡2，常銀子1a,1b，鄭 劍1a,1b，鄭旭衛3

（1. 浙江農林大學 a.農業與食品科學學院；b.浙江省農產品品質改良技術研究重點實驗室，浙江 臨安 311300；2.中國林業科學研究院 亞熱帶林業研究所，浙江 富陽 311400；3.浙江金華金山油脂有限公司，浙江 金華 321017）

為從油茶餅粕中提取蛋白，采用單因素實驗和正交實驗方法，研究了油茶餅粕蛋白堿提的重要影響因子，得到的最優制備條件為：起始pH值為10，溫度為50 ℃，料液比為1∶14，時間為60 min；在此堿提條件下，油茶餅粕蛋白的溶出率為47.9%。文中還就其酶解物對·OH的清除率的影響情況進行了實驗，結果得到的最佳水解條件為：起始pH值為10，酶解溫度為40 ℃，酶用量為1.0%、酶解時間為120 min；在此酶解條件下，酶解物對·OH的清除率達到38.9%。文中還對油茶餅粕蛋白活性肽的功能進行了分析，結果表明：當其濃度為150 μg/mL時，其對·OH和DPPH的清除率分別為34.49%和37.73%。

油茶餅粕蛋白；提取；酶解；活性

生物活性肽是有特定生理作用的多功能化合物的總稱[1]。這些多肽小的僅由2個氨基酸構成，大的有復雜的長鏈或環狀多肽，常經糖苷化、磷酸化或酰化衍生修飾[2]。

有關研究者[3-4]發現，人類攝食蛋白質，經消化道的酶作用后，大多是以小肽的形式消化吸收的，而以游離氨基酸形式吸收的比例很小[5]。生物活性肽結構復雜，由多種氨基酸組成，這直接導致其種類繁多，分布廣泛；其諸多生物活性（如降血壓、降低膽固醇、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強機體免疫力、抗氧化等功能）已引起了學者的關注[6]。

油茶餅粕蛋白是一種優良的蛋白質資源。有關分析結果表明，油茶仁果中含有10%～15%的蛋白質，采用冷榨工藝代替傳統的高溫焙烤再制油工藝，不但能提高油脂的品質，還可以較好地保護其蛋白的活性[7]。

蛋白質的提取方法已有多種，如水相法、水相酶解法、丙醇等有機溶劑提取法等種[8-9]。本研究采用堿提方法，以油茶餅粕蛋白的溶出率為指標，對其提取條件進行了優化，確定了得率最高的制備方案；制備獲得的蛋白，再經酶的有限水解，以羥基自由基清除率為考察指標，優化酶解條件；還對所獲得的酶解物進行了活性檢測，以期為分析其功能與結構特點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 油茶餅粕

供試的油茶餅粕為經低溫冷榨工藝制備山茶油后的餅粕。

1.2 試 劑

所用試劑為堿性蛋白酶等試劑。

1.3 儀 器

FZ102型植物粉碎機，天津市泰斯特有限公司；TDL-5-A低速臺式離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.4 樣品處理

油茶餅粕蛋白提取的工藝流程：油茶餅粕→粉碎→50 ℃溫水浸泡20 min除雜→更換浸泡液（去除水溶性的多糖、堿類等）→加堿→過濾→濾液中加酸調節至pH＝4.0→獲得沉淀物→離心→水洗沉淀至pH＝7→離心→將沉淀冷凍干燥備用。

酶解流程：提取所獲蛋白→加適量水溶解→調節pH 加蛋白酶→控制條件反應→滅酶→離心→上清液測·OH清除率。

1.5 堿提油茶餅粕蛋白的條件研究

（1）初始pH值對堿提效果的影響的實驗：在料液比為1∶10、溫度為50 ℃、提取時間為50 min的條件下連續提取，在初始pH值分別為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0時測定蛋白質的溶出率。

（2）溫度對堿提效果的影響的實驗：在起始pH值為10、料液比1∶10、提取時間50 min的條件下連續提取，在提取溫度分別為20、30、40、50、60 ℃時測定蛋白質的溶出率。

（3）料液比對堿提效果的影響的實驗：在起始pH值為10、溫度為50 ℃、提取時間為50 min的條件下連續提取，在料液比分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14時測定蛋白質的溶出率。

（4）浸提時間對堿提效果的影響的實驗：在起始pH值為10、浸提溫度為50 ℃、料液比為1∶10的條件下連續提取，在浸提時間分別為20、40、60、80、100 min時測定蛋白質的溶出率。

（5）正交實驗的因素與水平：根據以上單因素實驗的結果，用反應的起始pH值（A）、浸提溫度（B）、料液比（C）、浸提時間（D）作為實驗因素，以蛋白質溶出率為考察指標，對油茶餅粕蛋白堿提的參數進行了L9(43)的優化實驗，正交實驗的因素與水平見表1。

表 1 正交實驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.6 堿性蛋白酶水解油茶餅粕蛋白的條件研究

（1）起始pH值對水解油茶餅粕蛋白效果的影響的實驗：在酶解溫度為40 ℃、酶用量為0.9%、酶解時間為120 min的條件下連續酶解，在起始pH值分別為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0時測定酶解物對·OH的清除率。

（2）酶解溫度對水解油茶餅粕蛋白效果的影響的實驗：在起始pH值為10、酶用量為0.9%、酶解時間為120 min的條件下連續酶解，在酶解溫度分別20、30、40、50、60 ℃時測定酶解物對·OH的清除率。

（3）酶用量對水解油茶餅粕蛋白效果的影響的實驗：在起始pH值為10、酶解溫度為40 ℃、酶解時間為120 min的條件下連續酶解，在酶用量分別0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%時測定酶解物對·OH的清除率。

（4）酶解時間對水解油茶餅粕蛋白效果的影響的實驗：在起始pH值為10、酶解溫度為40 ℃、酶用量為0.9%的條件下連續酶解，在酶解時間分別為30、60、90、120、150 min時測定酶解物對·OH的清除率。

（5）正交實驗的因素與水平：在以上單因素研究的基礎上，用起始pH值（a）、酶解溫度（b）、酶用量（c）、酶解時間（d）作為實驗因素進行L9(43)的正交優化實驗，實驗因素與水平見表2。

表 2 正交實驗的因素與水平Table 2 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.7 酶解物對羥基自由基清除率的測定

參照文獻[10]中的有關方法測定酶解物對羥基自由基的清除率。

2 結果與分析

2.1 堿提油茶餅粕蛋白的實驗結果

2.1.1 起始pH值對油茶餅粕蛋白溶出率的影響

起始pH值對油茶餅粕蛋白溶出率的影響的實驗結果如圖1所示。由圖1可知，隨著pH值的升高，蛋白質的溶出率逐漸升高。當pH值為7時，油茶餅粕蛋白的溶出率為7.3%；當pH值為9時，油茶餅粕蛋白的溶出率為44.1%；而當pH值為11時，油茶餅粕蛋白的溶出率為47.3%。當pH值為7～9時，油茶餅粕蛋白的溶出率隨著pH值的增大而明顯上升；而當pH值為9～11時，油茶餅粕蛋白的溶出率趨于穩定。但當pH值較大時，提取液呈深褐色，同時其品質與功能都會遭到破壞。綜合分析可知，油茶餅粕蛋白的浸提溶液的pH值宜為8～10。

2.1.2 浸提時間對油茶餅粕蛋白溶出率的影響

浸提時間對油茶餅粕蛋白溶出率的影響的實驗結果如圖2所示。由圖2可知，隨著浸提時間的增加，油茶餅粕蛋白的溶出率隨之提高，最后趨于穩定。當浸提時間為20 min時，油茶餅粕蛋白的溶出率為3.7%；當浸提時間為60 min時，其蛋白溶出率為43.2%；而當浸提時間為100 min時，其蛋白溶出率為46.9%。實驗結果表明，浸提時間為20～60 min時，其蛋白溶出率逐漸提高；之后，油茶餅粕蛋白的溶出率趨于穩定。因此，浸提時間宜控制在50～70 min內。

圖1 pH值對油茶餅粕蛋白溶出率的影響Fig. 1 Effect of pH value on soluble rate of C. oleifera dregs proteins

圖2 酶解時間對油茶餅粕蛋白溶出率的影響Fig. 2 Effect of enzymolysis time on soluble rate ofC. oleifera dregs proteins

2.1.3 浸提溫度對油茶餅粕蛋白溶出率的影響

浸提溫度對油茶餅粕蛋白溶出率的影響的實驗結果如圖3所示。由圖3可知，油茶餅粕蛋白的溶出率隨著浸提溫度的升高而提高，直到浸提溫度在50 ℃左右時才開始急劇下降。當浸提溫度為20 ℃時，油茶餅粕蛋白的溶出率為33.7%；而當浸提溫度為50 ℃時，其蛋白溶出率提高到46.3%。這是因為，蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而升高，同時，溶液的粘度也有所下降，從而加快了化學反應，提高了浸提的速度。但當浸提溫度為60 ℃時，油茶餅粕蛋白的溶出率反而降到42.3%。這是因為，當浸提溫度在60 ℃時，油茶餅粕蛋白質已變性。綜合考慮得出，油茶餅粕蛋白的浸提溫度宜控制在40～50 ℃之間。

圖 3 酶解溫度對油茶餅粕蛋白溶出率的影響Fig. 3 Effect of enzymolysis temperature on solution rate of C. oleifera dregs proteins

2.1.4 料液比對油茶餅粕蛋白溶出率的影響

料液比對油茶餅粕蛋白溶出率的影響的實驗結果如圖4所示。由圖4可知，隨著料液比的升高，油茶餅粕蛋白的溶出率明顯上升。當料液比為1∶6時，油茶餅粕蛋白的溶出率為20.3%；當料液比為1∶10時，其蛋白溶出率為45.1%。這是因為，當料液比增大時，溶液的粘度隨之相對降低，溶液內部的阻力也就減小，分子擴散加快，其浸出速度也就加快。而當料液比為1∶14時，油茶餅粕蛋白的溶出率為47.5%，相對于料液比為1∶10時的油茶餅粕蛋白溶出率而言僅提高2.4%，提高幅度并不大。這是因為，蛋白質溶解于浸提液中已接近飽和狀態，過量的蛋白質并不能溶解。因此，料液比宜設在1∶10～1∶14之間。

圖4 料液比對油茶餅粕蛋白溶出率的影響Fig. 4 Effect of ratio of material to liquid on soluble rate of C. oleifera dregs proteins

2.1.5 堿提油茶餅粕蛋白的正交實驗結果

根據以上堿提油茶餅粕蛋白的各單因素實驗結果確定的正交實驗設計與實驗結果如表3。從表3中可以看出，各因素對堿提油茶餅粕蛋白溶出率影響的主次順序為A＞B＞C＞D，即起始pH值＞浸提溫度＞料液比＞浸提時間；堿提油茶餅粕蛋白的最優組合條件為A3B3C3D2，即起始pH值為10、浸提溫度為50 ℃、料液比為1∶14、時間為60 min。因為表3中由極差分析得到的最優組合未出現于此前的9個實驗方案中，故需進行驗證實驗，驗證結果表明，在此組合條件下，油茶餅粕蛋白的溶出率可達47.9%，由此證明，該組合條件為最優組合條件。

表 3 正交實驗設計及實驗結果Table 3 Design and results of the orthogonal experiment

2.2 堿性蛋白酶水解油茶餅粕蛋白的實驗結果

2.2.1 起始pH值對·OH清除率的影響

起始pH值對·OH清除率的影響的實驗結果如圖5所示。由圖5可知，隨著起始pH值的增大，酶解物對·OH的清除率先呈現出明顯的上升趨勢，然后急劇下降。當pH值為9.0時，其對·OH的清除率為6.4%；當pH值為10.0時，其對·OH的清除率達到38.2%；而當pH值為11.0時，其對·OH的清除率反而降到5.3%。這是因為，酶分子的活性部位由結合部位與催化部位組成，酶分子中的活化中心內的基團對pH值比較敏感，不同的pH值，活化中心的催化效果不同；由酶分子形成的空間構象是活化中心存在的前提，酶的催化能力與底物構象有關，底物構象有一定的pH環境要求，因此，要發揮最佳的催化功能，需要選取合適的pH值。實驗結果說明，pH值的適宜范圍為 9.5～ 10.5。

圖 5 pH值對·OH清除率的影響Fig. 5 Effect of pH value on ·OH scavenging rate

2.2.2 酶解溫度對·OH清除率的影響

酶解溫度對·OH清除率的影響的實驗結果如圖6所示。由圖6可知，隨著酶解溫度的升高，酶解物對·OH的清除率先呈上升趨勢，然后相對急劇下降。當酶解溫度為20 ℃時，其對·OH的清除率為35.9%；當酶解溫度為40 ℃時，其對·OH的清除率達到38.9%；而當酶解溫度達60 ℃時，其對·OH的清除率反而降到35.2%。這是因為，適宜的溫度能增加酶的活性，加快分子運動，從而加快水解速度，但如果溫度過高，則會導致酶蛋白變性、失活。所以，選用的酶解溫度范圍宜為35～45 ℃。

圖6 酶解溫度對·OH清除率的影響Fig. 6 Effect of temperature on ·OH scavenging rate

圖7 酶用量對·OH清除率的影響Fig. 7 Effect of enzyme dosage on ·OH scavenging rate

2.2.3 酶用量對·OH清除率的影響

酶用量對·OH清除率的影響的實驗結果如圖7所示。由圖7可知，隨著酶用量的增加，酶解物對·OH的清除率逐漸升高而后趨于穩定。當酶用量為0.3%時，酶解物對·OH的清除率為29.8%；當酶用量為0.9%時，其對·OH的清除率達到38.4%；而當酶用量達到1.1%時，其對·OH的清除率（38.8%）上升不明顯。這是因為，隨著酶用量的增加，水解液中的酶濃度也有所增加，使得水解程度加深，當所用的蛋白酶達到一定量時，蛋白完全被水解，所以，此時即使再增加酶的用量，也不能提高其對·OH的清除率。因此，實驗選用的酶用量在0.8%～1.0%之間。

2.2.4 酶解時間對·OH清除率的影響

酶解時間對·OH清除率的影響的實驗結果如圖8所示。由圖8可知，酶解物對·OH的清除率隨著酶解時間的增加先上升，當酶解時間達到120 min時便開始下降。當酶解時間為30 min時，酶解物對·OH的清除率為21.0%；當酶解時間為120 min時，其對·OH的清除率達到38.2%；但是，當酶解時間增加至150 min時，其對·OH的清除率反而降至34.1%。這是因為，隨著酶解時間的增加，酶解反應能夠充分地進行，而具有還原能力的蛋白酶解物的含量也隨之提高，所以酶解物對·OH的清除率有所提高。但是，當酶解時間過長時，具有強還原能力的肽段水解下來之后又進一步水解了，從而喪失了活性。所以，實驗選用的酶解時間為110～130 min。

圖 8 酶解時間對·OH清除率的影響Fig. 8 Effect of enzymolysis time on ·OH scavenging rate

2.2.5 堿性蛋白酶水解油茶餅粕蛋白的正交組合優化實驗結果

根據以上堿性蛋白酶水解油茶餅粕蛋白的各單個影響因素實驗結果確定的正交實驗設計與實驗結果如表4。從表4中可以看出，各因素對·OH清除率影響的主次順序為a ＞d＞c＞b，即起始pH值＞酶解時間＞酶用量＞酶解溫度；影響·OH清除率的最優組合條件為a2b2c3d2，即起始pH值為10、酶解溫度為40 ℃、酶用量為1.0%、酶解時間為120 min。由于由極差分析得到的最優組合未出現于此前的9個實驗方案中，故要進行驗證實驗。在此方案下進行實驗，得到的酶解物對·OH的清除率達到38.9%。由此證明，該組合條件為最優組合條件。

表 4 正交實驗設計及實驗結果Table 4 Design and results of the orthogonal experiment

2.3 油茶餅粕蛋白活性肽的功能分析

2.3.1 油茶餅粕蛋白活性肽對羥自由基（·OH）的清除率

不同濃度的酶解產物對·OH清除率的影響情況如圖9所示。由圖9可知，油茶餅粕蛋白活性肽對·OH的清除率隨著活性肽的質量濃度的變大而顯著提高，其對·OH的清除效果與其濃度間存在量效關系。當其濃度為150 μg/mL時，其對·OH的清除率可達34.49%。

圖 9 不同濃度的活性肽對·OH的清除率Fig. 9 ·OH scavenging rate under different concentrations of active peptides

2.3.2 油茶餅粕蛋白活性肽對DPPH自由基的清除率

不同濃度的油茶餅粕蛋白活性肽對DPPH自由基的清除率的影響情況如圖10所示。由圖10可知，油茶餅粕蛋白活性肽對DPPH的清除率隨著活性肽質量濃度的加大而提高，其對DPPH的清除率與其濃度間存在量效關系[11]。當活性肽的濃度為150 μg/mL時，其對DPPH的清除率高達37.73%。

圖10 不同濃度的活性肽對DPPH的清除率Fig. 10 DPPH scavenging rate under different concentrations of active peptides

3 結論與展望

本實驗以冷榨山茶油的餅粕為原料，用堿提工藝制備油茶餅粕蛋白，最優堿提條件為：起始pH值為10，浸提溫度為50 ℃，料液比為1∶14，浸提時間為60 min。在此條件下，油茶餅粕蛋白的溶出率為47.9%。

本實驗還用堿性蛋白酶酶解油茶餅粕蛋白，得到的最佳酶解條件為：起始pH值為10，酶解溫度為40 ℃，酶用量為1.0%，酶解時間為120 min。在此酶解條件下，油茶餅粕蛋白酶解物對·OH的清除率達到38.9%。

實驗測定了油茶餅粕蛋白酶解物的抗氧化性，考察了其對羥自由基（·OH）和 DPPH自由基的清除效果。結果表明：油茶餅粕蛋白酶解物具有抗氧化性，其活性與其濃度間呈量效關系。由此可進一步推測：油茶餅粕蛋白的酶解物中含有一些具有抗氧化功能的生物活性肽，這為進一步研究油茶餅粕抗氧化肽的精制與純化及其一級結構分析積累了基礎數據。

蛋白質資源匱乏是世界性研究課題，同時，許多珍貴的動植物蛋白又因技術手段的落后而被浪費；采用非加熱、非化學試劑制備植物油脂，從而更好地保護餅粕，這已經得到了學者及業內人士的認可；在這些餅粕中，采用溫和的酶水解技術，可以降解蛋白，以利于人和動物的消化吸收，與此同時，也有望獲得具有特殊功能的生物活性肽，這對于油料作物資源的綜合開發利用、豐富蛋白質來源及保護環境等方面都具有重要意義。

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Preparation and activity of enzymolysis products ofCamellia oleiferadregs proteins

WANG Chao1a,1b, ZHONG Shan-min1a,1b, ZHU Jun-peng1a,1b, LUO Fan2, CHANG Yin-zi1a,1b, ZHENG Jian1a,1b, ZHENG Xu-wei3
(1.a. The Key Laboratory for Quality Improvement of Agricultural Products of Zhejiang Province; b.College of Agriculture and Food Science, Zhejiang A&F university, Lin’an 311300, Zhejiang, China; 2. Research Institute of Subtropical Forestry,Chinese Academy of Forestry, Fuyang 311400, Zhejiang, China; 3. Zhejiang Jinhua Jinshan Limited Company, Jinhua 321017, Zhejiang, China)

In order to extract proteins fromCamellia oleiferadregs, some important effect factors ofC. oleiferadregs proteins with alkali extraction were researched, by several single factor experiments and an orthogonal experiment, and the optimal extraction processes were obtained, namely initial pH value 10, extraction temperature 50 ℃, solid-liquid ratio 1∶14 and extraction time 60 min. Under these extraction conditions, the extraction rate ofC. oleiferadregs protein reached 47.9%. The effects of enzymolysis products on scavenging rate of ·OH were analyzed, and the optimal enzymolysis conditions were obtained, namely initial pH value 10, enzymolysis temperature 40 ℃, enzyme dosage 1.0% and enzymolysis time 120 min. Under these enzymolysis conditions, the scavenging rate of ·OH reached 38.9%. The functions of protein active peptides fromC. oleiferadregs were analyzed, and the results showed that the scavenging rate of ·OH and DPPH were 34.49% and 37.73% when concentration of protein peptides was 150 μg/mL.

Camellia oleiferadregs proteins; extraction; enzymolysis; activity

S609.9；S794.4；TS22

A

1003—8981(2015)02—0034—07

2014-11-20

浙江省重點科技創新團隊項目(2011R50030)；浙江省重大科技專項計劃項目(2012C12005-1)；農業科技成果轉化資金項目(2013GB24320614)。

王 超，副教授，博士。

仲山民，教授，博士。E-mail：zhongsm2002@zafu.edu.cn

王 超,仲山民,朱俊朋,等. 油茶餅粕蛋白的制備及其酶解物活性分析[J].經濟林研究,2015,33(2):34－40.

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.02.006

http: //qks.csuft.edu.cn

[本文編校：伍敏濤]