適于轉錄組測序的棗不同器官總RNA提取方法篩選

魏琦琦，馮延芝 ，林 青，賈寶光 ，張 琳

（1.中南林業科技大學a.經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室；b.經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室；c.經濟林培育與利用湖南省2011協同創新中心，湖南 長沙 410004；2.中國林業科學研究院 經濟林研究開發中心，河南 鄭州 450003）

適于轉錄組測序的棗不同器官總RNA提取方法篩選

魏琦琦1a-c，馮延芝2，林 青1a-c，賈寶光1a-c，張 琳1a-c

（1.中南林業科技大學a.經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室；b.經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室；c.經濟林培育與利用湖南省2011協同創新中心，湖南 長沙 410004；2.中國林業科學研究院 經濟林研究開發中心，河南 鄭州 450003）

為獲得適用于轉錄組測序的棗花、結果枝和果實的總RNA提取方法，以中秋酥脆棗為材料，比較分析了Ambiogen和Autolab 2種總RNA提取試劑盒和基于Autolab試劑盒改良的CTAB法的總RNA的提取效果。結果表明：3種方法提取RNA的OD260/OD280差別不大，但用2種試劑盒提取的RNA有降解，其中Ambiogen試劑盒提取的花、結果枝和果實3個器官的RNA質量濃度分別為126、284和222 ng/μL；Autolab試劑盒提取的RNA質量濃度分別為307、402和266 ng/μL；基于Autolab試劑盒改良的CTAB法提取的RNA質量濃度分別為401、417和296 ng/μL。與2種試劑盒相比，基于Autolab試劑盒改良的CTAB法提取出來的RNA完整性好、純度和濃度高，能夠滿足轉錄組測序的要求。

中秋酥脆棗；轉錄組測序；RNA提取；RNA完整性

轉錄組測序是近年興起的一種高通量測序技術，其測序對象為特定細胞在某一功能狀態下所能轉錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA。轉錄組測序技術（RNA-seq）具有成本低、定量準確、可重復性高、檢測范圍廣和不受遺傳背景限制等優點，這在轉錄組學的應用上具有革命性意義[1-3]。轉錄組測序在cDNA文庫構建時對RNA的濃度、純度和完整性等均有較高的要求[4]。

棗Ziziphus jujuba為鼠李科Rhamnaceae棗屬Ziziphus落葉灌木，是原產于我國的重要經濟樹種和木本糧食作物[5]。棗樹栽培歷史悠久，具有重要的生態和經濟價值，是當前我國果樹和生態經濟林產業重點發展的樹種之一[6-7]。近年來，有關棗樹的研究多集中在棗的光合特性、果實性狀評價以及高效栽培技術等方面[8-12]，關于其分子生物學方面的研究報道較少。

有關植物總RNA提取方法的報道較多，但不同物種或同一物種的不同品種，甚至同一品種的不同器官（組織）組成成分差別較大，同一方法未必具有通用性，因此需要根據具體的品種或器官（組織）探索適宜的RNA提取方法[13-15]。棗不同器官（組織）中組分不同，如棗花和棗果實中含有大量的多酚、多糖和醌類等次生代謝物質，并且富含RNase，RNA極易被分離降解，給棗RNA的分離純化帶來許多困難[16]。目前已有一些棗RNA提取方法的研究報道[17-19]，但針對適用于棗不同器官轉錄組測序的RNA提取方法尚未見報道。基于此，本研究中使用了3種方法對棗花、結果枝和果實進行總RNA提取，比較了RNA的質量，為用于轉錄組測序的棗不同器官總RNA提取方法的建立提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗品種為5年生的中秋酥脆棗，栽植于湖南衡陽中南林業科技大學棗試驗基地，分別采集棗花、結果枝和果實，取樣品后迅速裝入滅菌的RNase-free離心管中，置于液氮中保存。

1.2 總RNA提取方法

選取Ambiogen試劑盒法（方法1）、Autolab試劑盒法（方法2）、基于Autolab試劑盒改良的CTAB法（方法3）3種方法分別對棗花、結果枝和果實進行總RNA的提取。方法1與方法2嚴格按該試劑盒操作說明提取即可。方法3在使用該試劑盒的基礎上，進行如下處理：（1）研磨好的樣品首先加入65 ℃預熱好的CTAB裂解緩沖液，在65 ℃水浴中溫浴10 min，在此期間渦旋振蕩5次；（2）加入 200 μL 的 KAc（5 mol/L）、600 μL 的氯仿/異戊醇（24∶1），渦旋振蕩5 min，然后冰浴10 min；（3）使用標準離心機13 000～14 000 r/min離心2 min，取450 μL上清液置于新的離心管中，加入450 μL該試劑盒中的RLT溶液，再次以同樣轉速離心2 min，以后步驟按試劑盒說明操作即可。

1.3 RNA質量檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測RNA的質量，然后用Agilent 2100檢測RNA的完整性、純度和濃度。

1.4 mRNA純化及文庫構建、測序

用NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module（NEB, E7490） 富 集 mRNA。 以 mRNA為模板，用NEBNext mRNA Library Prep Master Mix Set for Illumina（NEB, E6110） 和 NEBNext Multiplex Oligos for Illumina（NEB, E7500） 構建上機文庫。制備好的文庫用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測文庫插入片段的大小，然后用Library Quantification Kit-Illumina GA Universal（Kapa,KK4824）進行QPCR定量。檢測合格的文庫在Illumina cbot上進行簇的生成，最后用Illumina HiSeqTM 2000進行測序。

2 結果與分析

2.1 棗不同器官總RNA質量

轉錄組測序對樣本RNA質量有較高要求，一般要求RNA總量≥20 ng，質量濃度≥400 ng/μL，OD260/OD280為 1.8 ～ 2.2，OD260/OD230＞ 1.8，RNA完整性值≥8，28S/18S＞1.0。本試驗中分別用3種方法提取棗花、結果枝和果實的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測后，通過Agilent 2100進行總RNA質量分析，包括RNA完整性、濃度和純度等。

2.1.1 RNA完整性

使用方法1提取棗花、結果枝和棗果實的RNA的完整性值分別為5.1、5.2和2.4；方法2提取的RNA的完整性值分別為7.1、6.3和5.9；通過方法3獲得RNA的完整性值分別為8.3、9.5和8.6，使用方法1提取的棗的3個器官RNA的28S/18S分別為0.0、2.7和0.1；方法2提取RNA的28S/18S分別為1.9、2.3和0.0；而方法3提取RNA的28S/18S分別為2.5、1.7和2.4（見表1）。從Agilent 2100檢測圖上也可看出方法1和方法2提取的RNA明顯有降解（見圖1和圖2），RNA完整性差，方法3提取的RNA完整性最好（見圖3）。

表 1 不同提取方法對中秋酥脆棗各器官總RNA提取結果比較Table 1 Comparison of the total RNAs extracted from different organs in Z. jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’ with different methods

圖 1 Agilent 2100 RNA芯片對方法1提取中秋酥脆棗的總RNA電泳結果質量Fig. 1 The electrophoresis result of total RNAs extracted from Z. jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’ with method 1 and Agilent 2100 RNA chip

圖 2 Agilent 2100 RNA芯片對方法2提取中秋酥脆棗的總RNA電泳結果質量Fig. 2 The electrophoresis result of total RNAs extracted from Z. jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’ with method 2 and Agilent 2100 RNA chip

2.1.2 RNA質量濃度

方法1提取的RNA質量濃度分別為126、284和222 ng/μL；方法 2提取的 RNA質量濃度分別為307、402和266 ng/μL；方法3提取的RNA質量濃度分別為401、417和296 ng/μL，由此可看出方法3提取的RNA質量濃度最高。

2.1.3 RNA純度

3種方法提取的RNA的OD260/OD280值沒有顯著差異，均在1.8～2.0，但方法3提取花、結果枝和果實RNA的OD260/OD280分別為1.93、1.98和1.83。使用方法1提取的RNA的OD260/OD230值分別為0.97、2.09和1.38，可見棗花和果實RNA的OD260/OD230值低于1.8；方法2提取RNA的OD260/OD230值分別為2.01、2.11和1.89；方法3提取RNA的OD260/OD230值分別為2.05、2.12和1.98。由此可見方法3提取的RNA的OD260/OD280值和OD260/OD230值高于2種試劑盒法，說明方法3提取的RNA純度高，沒有被污染。

綜上所述，在3種提取棗花、結果枝和果實的總RNA方法中，方法3效果最好。即基于Autolab試劑盒改良的CTAB法獲得的總RNA濃度高、純度高、完整性好，滿足轉錄組測序和cDNA文庫構建的需求。

圖 3 Agilent 2100 RNA芯片對方法3提取中秋酥脆棗的總RNA電泳結果質量Fig. 3 The electrophoresis result of total RNAs extracted from Z. jujuba cv. ‘Zhongqiusucui’ with method 3 and Agilent 2100 RNA chip

圖 4 分離純化后的mRNA瓊脂糖電泳圖Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of puri fi ed mRNAs

2.2 mRNA的分離純化

mRNA質量直接關系到文庫的質量，在本研究中，分離純化后的mRNA經電泳檢測，其覆蓋范圍集中于250～2 000 bp之間（見圖4），表明純化的mRNA中應該包含大量該時期表達的基因。經核酸蛋白檢測儀檢測，棗花mRNA的OD260/OD280為1.98，OD260/OD230為 2.01，質量濃度為 310 ng/μL；棗結果枝mRNA的OD260/OD280和OD260/OD230分別是1.99和2.12，質量濃度為325 ng/μL；棗果實mRNA的OD260/OD280和OD260/OD230分別是1.93和1.98，質量濃度為287 ng/μL，說明mRNA樣品中沒有蛋白質、其它有機和無機離子的污染或被污染程度極低，能滿足轉錄組測序和文庫構建的需要。

2.3 cDNA文庫構建及測序

將mRNA等量混合后，進行cDNA文庫構建，然后進行轉錄組測序，最終獲得34 587條Unigene。進一步表明，方法3即基于Autolab試劑盒改良的CTAB法可以成功提取高質量的RNA，能夠滿足栆花、結果枝、果實等器官轉錄組測序的質量標準。

3 結論與討論

目前，已有較多關于植物RNA提取方法的報道，但各RNA提取方法有其優點和缺點，不同植物適用的提取方法也不同[20-23]。轉錄組測序等分子生物學研究對RNA的質量要求較高，因此找到一種適用于轉錄組測序的RNA提取方法尤為重要。但在棗組織中含有使RNA極易被降解的次生代謝物質以及RNase，增加了提取高質量RNA的難度，所以在試驗過程中所有的儀器設備都要經過嚴格處理，防止RNA被降解，從而選擇適宜的方法提取RNA，才能更好地進行轉錄組測序和cDNA文庫建立等研究工作。

該研究中以中秋酥脆棗為材料，采用Ambiogen試劑盒、Autolab試劑盒和基于Autolab試劑盒改良的CTAB法分別提取棗花、結果枝和果實總RNA，并對其提取效果進行了比較分析。其中Ambiogen試劑盒提取的RNA濃度和純度較低，而且棗花和棗果實的OD260/OD280值＜1.8，棗果實的OD260/OD280值＜1.8，棗花和棗果實的RNA 28S/18S值＜1.0，其RIN值分別為5.1、5.2和2.4，可見其RNA有降解，完整性不好，故該方法提取的RNA沒有達到試驗標準；Autolab試劑盒提取的RNA濃度和純度雖達到要求，但其RNA的28S/18S值＜1.0，RIN值＜8，完整性略差，不能很好地滿足試驗要求；基于Autolab試劑盒改良CTAB法提取的RNA質量濃度分別為401、417和296 ng/μL，其OD260/OD280值為1.8～2.2、OD260/OD230值＞1.8，RIN 值分別為 8.3、9.5和8.6，由此可見該方法提取的RNA各方面均達試驗要求。因此基于Autolab試劑盒改良CTAB法提取的RNA不論是濃度、純度還是完整性均是最好的，Autolab試劑盒法次之，再次是Ambiogen試劑盒法。

獲得高質量的總RNA是進行轉錄組測序的前提，本研究結果表明：基于Autolab試劑盒改良CTAB法提取的棗花、棗結果枝和棗果實的RNA濃度高、純度和完整性最好，滿足轉錄組測序、cDNA文庫構建及RT-PCR等需要高質量RNA的試驗需求，是提取棗總RNA的首選方法。

[1]林 燕,李 菲,張淑江,等.適用于轉錄組測序的大白菜小孢子總RNA提取方法篩選[J].中國蔬菜,2014,1(11):15－19.

[2]井趙斌,魏 琳,俞 靚,等.轉錄組測序及其在牧草基因資源發掘中的應用前景[J].草業科學,2011,28(7):1364－1369.

[3]Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics [J]. Nature Research Genetics, 2009, 10(1):57－63.

[4]李 宏,王新力.植物組織RNA提取的難點及對策[J].生物技術通報,1999,(1):36－39.

[5]劉青柏,劉明國,劉明忠,等.朝陽地區不同品種棗樹光合及水分利用特征研究[J].經濟林研究,2013,31(3):16－20.

[6]趙 錦,劉中成,代 麗,等.棗不同器官和組織RNA提取方法的研究[J].植物遺傳資源學報,2009,10(1):111－117.

[7]原勤勤,文亞峰,劉 儒,等.棗優良品種親緣關系的ISSR分析[J].經濟林研究,2012,30(1):56－61.

[8]張 舟,呂芳德,王 森.不同棗品種光合特性的比較研究[J].中南林業科技大學學報,2014,34(8):78－81.

[9]謝建秋,袁德義,陳文濤.浙西南引種鮮食棗果實性狀綜合評價[J].浙江林業科技,2013,33(6):19－23.

[10]王志偉,呂芳德,王 森.根外施肥對中秋酥脆棗幼樹營養生長的影響[J].經濟林研究,2013,31(2):96－99.

[11]周俊義.棗高效栽培教材[M].北京:金盾出版社,2009:1－10.

[12]張 萍,史彥江,宋鋒惠,等.南疆灰棗主要營養品質性狀的變異及相關性研究[J].果樹學報,2011,28(1):77－81.

[13]Ainsworth C. Isolation of RNA from floral tissue of Rum exacetosa (sorrel) [J]. Plant Moleculer Biology Reporter, 1994,12(3): 198－203.

[14]Lewin sohn E, Steele C L, Croteau R. Simple isolation of functional RNA from woody stems of gym nosperms [J]. Plant Moleculer Biology Reporter, 1994, 12(1): 20－25.

[15]Su X, Gibor A. A method for RNA isolation from marine macroalgae [J]. Anal Biochem,1988,174:650－657.

[16]李繼東,武應霞,馮建燦,等.棗RNA提取方法的比較[J].經濟林研究,2010,28(4):15.

[17]馮延芝,袁德義,張 琳,等.棗花蕾總RNA提取方法的比較[J].經濟林研究,2012,30(2):88－90.

[18]劉中成.棗總RNA提取及mRNA差異顯示技術體系的建立[D].保定:河北農業大學,2012.

[19]韓 斌.棗果實總RNA的提取及其反轉錄技術體系的建立[D].保定:河北農業大學,2006.

[20]Chang S J, Puryear J, Cainey J. A simple and ef fi cient method for RNA isolating from pine trees [J]. Plant Molecular Biology Reporter, 1993, 11(2): 113－116.

[21]Liu Y Z, Liu Q, Tao N G,et al.Ef fi cient Isolation of RNA from Fruit Peel and Pulp of Ripening Navel Orange (Citrus sinensisOsbeck) [J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2006,25(3): 300－304.

[22]徐昌杰,陳昆松,張 波.柑橘組織RNA提取方法研究[J].果樹學報,2004,21(2):136－140.

[23]李曉穎,曹 雪,房經貴.杏葉片與果實總RNA提取方法研究[J].中國農學通報,2010,26(2):152－156.

Screening of total RNA extraction methods for RNA-sequences from different organs inZiziphus jujuba

WEI Qi-qi1a-c, FENG Yan-zhi2, LIN Qing1a-c, JIA Bao-guang1a-c, ZHANG Lin1a-c
(1. a. The Key Lab of Non-wood Forest Products of State Forestry Administration; b. The Key Lab of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees of Education Ministry; c. 2011 Cooperative Innovation Center of Cultivation and Utilization for Non-Wood Forest Trees of Hunan Province, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. The Center of Research and Development for Non-wood Forest Tree, Chinese Academy of Forestry, Zhengzhou 450003, Henan, China)

In order to obtain the methods for high-quality total RNA extraction from fl ower, fruit bearing branch and fruit inZiziphus jujuba, takingZ. jujubacv. ‘Zhongqiusucui’ as materials, and the RNA extraction effects were compared using two kinds of total RNA extraction kits (Ambiogen and Autolab) and modi fi ed CTAB method based on the Autolab RNA extraction kit. The results showed thatOD260/OD280values of the RNA extracted by using the three RNA extraction methods had no signi fi cant differences, but a part of RNAs obtained by the two RNA extraction kits were degraded. The RNA mass concentrations from fl ower, fruit bearing branch and fruit were 126, 284 and 222 ng/μL by using the RNA extraction kit of Ambiogen; the RNA mass concentrations were 307, 402 and 266 ng/μL by using the RNA extraction kit of Autolab; and the RNA mass concentrations were 401, 417 and 296 ng/μL by using the modi fi ed CTAB method based on the Autolab RNA extraction kit, respectively. The modi fi ed CTAB method could generate high-integrity, high-concentration and high-purity RNA that could meet the request of transcriptome sequencing, compared with the two extraction kits.

Ziziphus jujubacv. ‘Zhongqiusucui’; transcriptome sequencing; RNA extraction; RNA integrity

S665.1

A

1003—8981(2015)02—0063—05

2014-12-20

國家“十二五”農村領域科技計劃課題（2013BAD14B03）。

魏琦琦，碩士研究生。

張 琳，副教授，博士。E-mail：triwoodtim918@126.com

魏琦琦,馮延芝,林 青,等.適于轉錄組測序的棗不同器官總RNA提取方法篩選[J].經濟林研究,2015,33(2):63－67.

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.02.011

http: //qks.csuft.edu.cn

[本文編校：聞 麗]