楊梅全基因組測序結果初報

戚行江，任海英，梁森苗，鄭錫良，吳陽春

（浙江省農業科學院園藝研究所，浙江杭州 310021）

楊梅全基因組測序結果初報

戚行江，任海英，梁森苗，鄭錫良，吳陽春

（浙江省農業科學院園藝研究所，浙江杭州 310021）

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）是我國南方著名的特產珍果，為促進楊梅分子育種及功能基因研究，對楊梅進行了全基因組測序。采用Illum ina Hiseq 2500雙端測序策略，構建了200 bp文庫，進行雙端125 bp（PE 125）測序，得到約13.70 Gb的原始數據。數據評估得知楊梅基因組大小約為304.38 Mb，重復序列含量約為45.82%，雜合率約為0.58%，基因組的GC含量約37.99%。利用SOAPdenovo軟件進行了拼接組裝。這一結果有助于開展楊梅后續的分子育種及基因功能研究。

楊梅；全基因組測序；基因組特征評估

楊梅（Myrica rubra Sieb.et Zucc.）是我國南方著名的特產珍果，果實色澤鮮艷，酸甜適口，風味獨特，營養豐富，深受人們喜愛。浙江省楊梅種植歷史悠久，是世界上最早對楊梅進行人工栽培的地區。2015年浙江省楊梅實際栽培面積近8.67萬hm2，產量近50萬t，栽培面積和產量均居全國第一，是浙江省僅次于柑橘的第二大果樹。目前，浙江省已成為中國乃至世界楊梅產業中心，楊梅產業在浙江省特色農業生產中有著特殊的地位和作用，現已成為浙江省“三農”經濟發展以及農民脫貧致富的重要產業。

楊梅產業在浙江省還在不斷發展之中，但隨著面積的不斷發展與產量的持續上升，楊梅生產問題也在日益突現，在品種方面表現尤為明顯，四大良種東魁、荸薺種、丁岙楊梅、晚稻楊梅等，這些品種的育成均采用系統優選獲得，雖然性狀上存在差異，但類型仍然較為相似，不同品種的熟期間隔不大，且均存在樹形高大、始果期遲、果實不耐貯藏、抗病性不足等問題。為了培育更優良的品種，更新楊梅育種技術與育種手段成為產業的迫切需求，楊梅的雌雄種質及不同品種在分子標記上存在重要差異［1-2］，這為分子育種提供了重要信息，但是尚不能滿足更深入的產業需求。

隨著科學技術的快速發展，轉錄組測序、基因組全測序已經成為研究動物［3-4］、植物［5-6］、病原生物［7］等的重要技術手段，這大大加速了人類對于研究目標的認知速度，有利于更好更快的利用分子技術改良物種。目前已經對十幾種果樹進行了全基因組測序，這大大促進了果樹科學的發展［8］。為了更好地從分子水平深入了解楊梅的生長性能、品質和抗病性等種質特性，促進楊梅分子育種及功能基因研究，本文對楊梅進行了全基因組測序。

1 材料與方法

1.1 文庫的構建及測序

楊梅嫩葉送北京百邁客生物科技有限公司進行檢測。CTAB方法提取楊梅嫩葉基因組DNA，進行小片段文庫建庫測序。用Qubit dsDNA HS Assay Kit（Life technologies）對基因組DNA進行精確定量。

小文庫構建。取500 ng基因組DNA用1×TE稀釋至50μL，用超聲法進行機械打斷，用QIAquick PCR purification Kit（QIAGEN）對片段化DNA進行純化；在T4 polynucleotide kinase、T4 DNA polymerase、Klenow Large Fragment和dNTP（New England Biolabs，NEB）的反應體系催化下對片段化的DNA進行修復，形成5'端帶有磷酸基團的平末端序列，并用QIAquick PCR purification Kit（QIAGEN）進行純化；在Klenow Fragment（exo-）（NEB）的催化下，在上述DNA的3'端添加連接反應所需的A堿基，并用M inElute PCR purification Kit（QIAGEN）進行純化；將不含barcode的Illumina paired-end adapters連接到待測DNA片段兩端，并用MinElute PCR purification Kit（QIAGEN）進行純化；用2%的低分子量瓊脂糖（BioRad）凝膠電泳對純化連接產物進行分離，切膠選擇300 bp（插入片段200 bp），用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）對分離膠塊進行純化；用帶有可以區分文庫的index引物對膠回收片段進行擴增富集，并對PCR產物再次進行瓊脂糖凝膠電泳切膠純化，最終獲得可用于測序的文庫。用7500 DNA LabChip芯片在Agilent Technologies 2100生物分析儀上對所得文庫片段大小進行質檢，用qPCR定量方式對文庫進行精確定量。根據qPCR定量結果對不同文庫進行混樣，在Illumina HiSeq 2500測序儀上按照雙端125 bp進行測序。

1.2 信息分析流程

雙端測序數據通過評估（GC分布統計、質量值Q20、Q30評估）、過濾后得到高質量的數據（clean reads），用于基因組特征評估。

1.3 基因組特征評估

利用基因組調研圖進行基因組特征的評估，評估基因組大小、雜合情況及GC含量情況。

2 結果與分析

2.1 測序結果統計

使用楊梅樣品的基因組DNA構建200 bp的文庫，在Illumina Hiseq 2500測序平臺測序得到13.70 Gb原始數據，總測序深度約為45.01X，測序質量值在20以上的堿基比例在93.25%以上，測序質量值在30以上的堿基比例在88.32%以上。

2.2 基因組大小、重復序列比例和雜合率評估

利用200 bp文庫數據構建Kmer長度為17的Kmer分布圖（圖1），進行基因組大小、重復序列比率和雜合率的評估。由圖1可知，平均Kmer深度即主峰對應的Kmer深度為37.56X。Kmer深度出現在主峰對應深度2倍以上的序列為重復序列，即深度大于75.12X（主峰右側的小峰）的Kmer序列為重復序列。Kmer深度出現在主峰對應深度18.78X處（主峰左側的小峰）的序列即為雜合序列。

根據Kmer深度信息，總Kmer數目/平均Kmer深度即為基因組大小，估計基因組大小約304.38 Mb。依據Kmer分布情況，估計重復序列含量約45.82%，沒有明顯雜合峰，評估出的雜合率約為0.58%，物種雜合率較低。因此該物種不屬于高雜合、高重復、大基因組等基因組結構特征復雜的物種。

圖1 Kmer的分布

2.3 評估GC含量

基因組GC含量對基因組測序的隨機性有較大影響。過高GC含量（＞65%），過低GC含量（＜25%）會導致測序偏向性，嚴重影響基因組組裝效果。物種GC含量是評估后續基因組組裝難度重要指標之一。通過對調研圖文庫測序數據分析，該物種基因組的GC含量約37.99%。

3 討論

楊梅全基因組大小約304.38 Mb，與其他已完成全基因組測序的果樹相比，比蘋果（基因組大小742 Mb）［9］、梨（基因組大小527 Mb）［10］、獼猴桃（基因組大小616.1 Mb）［5］、香蕉（基因組大小523 Mb）［11］、葡萄（基因組大小490 Mb）［12］、楊樹（基因組大小480 Mb）都小的多，但是與番木瓜（基因組大小370 Mb）［13］、桃樹（基因組大小265 Mb）［14］、甜橙（基因組大小367 Mb）［15］較接近。與其他已完成全基因組測序的作物和蔬菜相比，比大麥（全基因組大小5.1 Gb）、小麥（全基因組大小17 Gb）、大豆（全基因組大小1.1 Gb）、玉米（全基因組大小2.3 Gb）、馬鈴薯（全基因組大小844 Mb）、棉花（全基因組大小775 Mb）、高粱（全基因組大小730 Mb）、水稻（全基因組大小466 Mb）、番茄（全基因組大小760 Mb）、白菜（全基因組大小485 Mb）和西瓜（全基因組大小425 Mb）等小很多，與甜瓜（全基因組大小375 Mb）和黃瓜（全基因組大小350 Mb）等接近，但是比擬南芥（全基因組大小125 Mb）要大得多。

楊梅的基因重復序列（重復序列45.82%）與葡萄（重復序列41%）、番木瓜（重復序列43%）和香蕉（重復序列44%）相近，在41%～46%，比蘋果（重復序列67%）和梨（重復序列53.1%）低，比草莓（重復序列23%）、甜橙（重復序列20%）和桃（重復序列37.14%）要高［8］，這說明楊梅的基因組屬于中等復雜程度。

如何破解并利用全基因組測序得到的大量數據是研究者面臨的巨大挑戰。目前基于全基因組測序挖掘了很多與糖、揮發性物質等相關的基因，并在開發SNP芯片、構建高精度圖譜及QTL定位等方面都取得了重要進展［8］。以后的科學研究重點將從表現型依賴型研究轉入基因型依賴型研究，從對單一基因的研究轉入對整個基因組的研究［8］。本文研究成果對于揭示楊梅生長特性的遺傳基礎提供重要的科學價值。

［1］ 謝小波，求盈盈，戚行江，等.楊梅雌、雄種質遺傳關系的RAPD和ISSR分析［J］.果樹學報，2008，25（2）：198-202.

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（責任編輯：張 韻）

S 667.6

：A

：0528-9017（2015）10-1564-03

文獻著錄格式：戚行江，任海英，梁森苗，等.楊梅全基因組測序結果初報［J］.浙江農業科學，2015，56（10）：1564-1566.

10.16178/j.issn.0528-9017.20151011

2015-08-24

國家公益性行業（農業）科研專項經費（201203089）；浙江省果品農業新品種選育重大科技專項（2012C12904-3）；浙江省農業科學院楊梅工程中心基金

戚行江（1963-），浙江諸暨人，研究員，碩士生導師，研究方向為果樹學。E-mail：qixj@mail.zaas.ac.cn。