丙戊酸鈉聯合全反式維甲酸促進子宮頸癌細胞衰老的發生

尤青葉，馮定慶，凌 斌，3，張紅麗，李 兵，伍嬌嬌，趙婷婷

丙戊酸鈉聯合全反式維甲酸促進子宮頸癌細胞衰老的發生

尤青葉1，馮定慶2，凌 斌1，3，張紅麗1，李 兵1，伍嬌嬌1，趙婷婷1

目的研究丙戊酸鈉（VPA）聯合全反式維甲酸（ATRA）誘導子宮頸癌細胞衰老作用，并探討其分子機制。方法實驗分為對照組、VPA組、ATRA組、VPA＋ATRA組，采用3 mmol／L VPA、1 μmol／L ATRA單獨或聯合作用于人子宮頸癌HeLa及SiHa細胞，對照組僅加溶媒；采用CellTiter 96?AQueous法檢測細胞增殖；β-半乳糖苷酶化學染色法檢測細胞衰老；Q-PCR和Western blot法分別檢測衰老相關基因P16、P63、hTERT的mRNA和蛋白表達變化。結果VPA對HeLa及SiHa細胞均有生長抑制作用，與ATRA聯合抑制效果明顯優于單獨用藥（P＜0.05）；β-半乳糖苷酶染色顯示，VPA＋ATRA組衰老細胞比例顯著增加，與對照組及VPA組、ATRA組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；QPCR和Western blot法結果顯示，VPA單獨和聯合ATRA可上調P16、P63的表達，降低hTERT的表達，且聯合用藥優于單獨用藥及對照組（P＜0.05）。結論 VPA聯合ATRA可抑制子宮頸癌細胞增殖，上調P16和P63的表達，下調hTERT的表達，可能是其誘導細胞衰老的分子機制。

子宮頸癌；丙戊酸；維甲酸；細胞衰老

近年來子宮頸癌的發病率有明顯上升和年輕化趨勢，發病率以每年2%～3%的速度增長［1］。早期子宮頸癌患者可采用手術治療，而晚期患者主要以鉑類化療為主，但毒副作用大，患者易對其產生耐藥性，患者生存率大大降低［2－3］。丙戊酸鈉（valproate acid，VPA）是一種傳統的抗癲癇藥物，同時也是一種組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑，高效、安全、低毒、可口服的特點使其極具臨床前景。全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）是維生素A的生物活性代謝產物，與其受體結合，具有促進上皮細胞分化成熟的作用，已作為一種誘導分化劑用于臨床腫瘤的治療。研究［4-5］證實VPA聯合ATRA可使子宮頸癌細胞發生細胞周期阻滯，并誘導細胞分化，但細胞凋亡增加不明顯。該研究進一步分析VPA聯合ATRA的抗子宮頸癌作用，觀察其對細胞衰老的影響并探討其可能的分子機制，為尋求新的子宮頸癌治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑VPA購自杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，用PBS稀釋成600 mmol／L的儲存液，－20℃保存；ATRA購自美國Sigma公司，用DMSO稀釋成833 mmol／L的儲存液，－20℃保存；CellTiter 96?AQueous購自美國Promega公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；P16、P63、hTERT抗體購自英國Abcam公司；相應蛋白的辣根酶標記二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DMEM培養基購自美國GIBCO公司；新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；ECL-增強化學發光檢測試劑購自瑞士羅氏公司；BIORAD化學發光儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 細胞培養及分組人子宮頸癌細胞株HeLa與SiHa購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所。細胞培養于含有10%小牛血清、100 U／ml青霉素和100 U／ml鏈霉素的DMEM培養基中，于37℃、5%CO2孵箱孵育，48 h換液1次，取對數生長期細胞進行實驗。實驗分為對照組、VPA組、ATRA組、VPA＋ATRA組。各組藥物終濃度為VPA 3 mmol／L、ATRA 1 μmol／L。觀察48 h。

1.3 CellTiter 96?AQueous法檢測細胞增殖取對數生長期的HeLa及SiHa細胞經胰酶消化制成細胞懸液，以1 500個／孔的密度接種于96孔板，37℃、5%CO2培養24 h后，各用藥組分別加入相應的藥物，對照組僅加溶媒，每組設3個復孔。分別于24、48、72、96 h加CellTiter 96?AQueous工作液，1 h后酶標儀490 nm波長處檢測各孔吸光度（optical density，OD）值。生長抑制率（%）＝（用藥組OD值－對照組OD值）／對照組OD值×100%。實驗重復3次。

1.4 β-半乳糖苷酶染色法檢測細胞衰老取對數生長期細胞，制成單細胞混懸液，以1×106個／ml的密度接種于6孔板，37℃、5%CO2培養24 h后，各用藥組分別加入相應的藥物，對照組用溶媒處理。孵育48 h后吸除培養液，PBS洗滌2次，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min后吸除固定液，PBS洗滌3次，加入1 ml染色工作液，37℃孵育過夜，第2天取出用PBS洗滌，再加1次PBS保留，顯微鏡下觀察并拍照。衰老指數（%）＝（陽性細胞數／總細胞數）×100%。

1.5 Q-PCR法檢測P16、P63、hTERT mRNA的表達收集細胞加入TRIzol，提取總RNA，按照Prime-Script?RT操作說明配制逆轉錄反應體系，逆轉錄合成cDNA。P16、P63、hTERT引物序列及擴增產物大小見表1（PCR引物序列檢測的P63為TAP63亞型）。按照SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒說明設置反應體系及參數，進行熒光定量PCR的檢測，按照2－ΔCt即2－（目的基因Ct－管家基因Ct）計算各基因的相對表達量。實驗重復3次，結果取平均值。

1.6 Western blot法檢測子宮頸癌細胞株中P16、P63、hTERT的表達收集細胞加入RIPA裂解細胞，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。分別配制6%和8%的SDS-PAGE電泳凝膠，恒壓電泳分離；半干法恒壓15 V轉膜30 min；4℃搖床上封閉過夜。加入一抗P16（1∶1 000）、P63（1∶500）、hTERT（1∶1 000）和內參照GAPDH抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜；分別加入相應的二抗（1∶1 000），室溫孵育2 h，ECL-增強化學發光檢測試劑顯色，BIORAD化學發光儀進行檢測。

表1 RT-PCR引物序列

1.7 統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，數據以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 VPA聯合ATRA抑制子宮頸癌細胞增殖CellTiter 96?AQueous法檢測結果顯示VPA和ATRA對HeLa、SiHa細胞均有增殖抑制作用，兩藥聯合則具有協同／相加的作用，與VPA組、ATRA組及對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 VPA聯合ATRA促進HeLa、SiHa細胞衰老β-半乳糖苷酶染色結果顯示，對照組HeLa細胞β-半乳糖苷酶陽性率為（5.3±1.61）%，SiHa細胞為（3.6±1.56）%；VPA＋ATRA組衰老指數顯著增加，其中HeLa細胞為（27.5±4.46）%，SiHa細胞為（35.33±4.55）%，與其他各組比較差異均有統計學意義（F＝106.7，P＜0.05）。提示VPA聯合ATRA能夠顯著促進子宮頸癌細胞的衰老，見圖2。

2.3 衰老相關基因mRNA的表達變化Q-PCR法檢測結果顯示HeLa、SiHa細胞經藥物處理48 h后，與對照組比較，VPA可上調P16、P63的mRNA表達水平（F＝39.51，P＜0.05）；與對照組比較，VPA＋ATRA組SiHa細胞中P16的表達水平上調（P＜0.05），HeLa細胞中P16、P63表達水平和SiHa細胞中P63表達水平顯著上調（P＜0.01）；VPA＋ATRA組與VPA組、ATRA組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），但SiHa細胞中P16表達水平VPA＋ATRA組與VPA組、ATRA組比較差異無統計學意義。與對照組比較，HeLa、SiHa細胞中VPA組和VPA＋ATRA組均能降低hTERT mRNA表達水平（P＜0.05）；VPA＋ATRA組強于VPA組、ATRA組（P＜0.01）。見圖3。

2.4 P16、P63及hTERT的蛋白表達水平變化與各基因mRNA表達變化一致，HeLa、SiHa細胞經VPA單獨和聯合ATRA處理后，P16、P63的蛋白表達水平明顯升高，而hTERT的蛋白表達水平顯著降低，VPA＋ATRA組與對照組及VPA組、ATRA組比較差異均有統計學意義（F＝40.56，P＜0.05），見圖4。

3 討論

在多種腫瘤中存在的結構或表達異常、組蛋白乙酰化水平異常，從而導致了特定抑癌基因的表達抑制。研究［6］顯示HDAC抑制劑能夠與HDAC特異性結合并抑制其活性，促進組蛋白的乙酰化修飾，上調相關抑癌基因的表達，在多種腫瘤中顯示了抗腫瘤作用。HDAC抑制劑可能通過多種途徑起到抗腫瘤作用，包括調控多種細胞凋亡途徑及凋亡相關蛋白的表達及其穩定性，誘導腫瘤細胞生長停滯、分化或細胞凋亡［7］，也可能抑制腫瘤血管的生成，影響腫瘤細胞的侵襲和轉移［8］。除了內在的抗腫瘤活性，HDAC抑制劑還可增加對傳統的細胞毒性藥物和腫瘤細胞放射的敏感性。研究［4－5］表明，VPA是一種HDAC抑制劑，聯合ATRA可通過誘導細胞分化而發揮抗子宮頸癌作用。本研究顯示VPA與ATRA聯合用藥可促進子宮頸癌細胞衰老。

既往研究［9］顯示，VPA聯合ATRA可調控多種基因表達，包括多種抑癌基因。本研究顯示兩藥聯合上調P16和P63的表達。P16是目前已經明確的一種重要的抑癌基因，其主要通過p16-cyclinD／CDK-RB途徑對細胞周期進行調控。研究［10］顯示細胞發生衰老時，P16表達明顯升高，當年輕的細胞中導入P16基因細胞可出現衰老表型，提示P16是細胞壽限的關鍵調控基因之一。Duan et al［11］以P16正反義載體分別轉染年輕的人成纖維細胞，發現P16過表達抑制了RB磷酸化從而引起細胞早衰而其反義載體轉染可以延緩細胞衰老。說明P16的積累不是衰老的結果而是衰老的誘因。P63是近幾年來新發現的P53蛋白家族成員，其在上皮細胞發育，基因中兩個不同的啟動子，將其翻譯產物分為兩種亞型，即反式激活域完整的TAP63和反式激活域N端截短的△NP63。TAP63轉錄激活（TA）結構域與P53的TA結構域具有同源性，可以激活P53的下游基因，具有與P53相似的抑制腫瘤細胞生長，誘導細胞周期停滯和細胞凋亡的作用。Truong et al［12］認為TAP63具有促進腫瘤細胞衰老的作用。目前研究［13］表明，HDAC抑制劑所誘導的細胞衰老部分是由P63介導的，這可能與不同細胞系特性和不同類型HDAC抑制劑作用的差別有關。

腫瘤細胞發生衰老是由很多因素參與在內的。hTERT是人類端粒酶蛋白的催化亞單位，其表達水平與細胞衰老密切相關。本研究顯示VPA聯合ATRA誘導衰老的子宮頸癌細胞中hTERT表達水平顯著降低。hTERT能激活端粒酶，端粒酶是細胞中負責端粒延長的一種酶，其能延長縮短的端粒，當端粒酶合成端粒難以彌補縮短的端粒時，端粒將進行性縮短，從而誘導體內細胞衰老。有研究［14］提示hTERT在腫瘤細胞、干細胞等永生化細胞中的表達水平很高，防止細胞因端粒縮短而發生細胞衰老、凋亡。由此可見，端粒、端粒酶在細胞衰老和腫瘤的發生中具有重要的作用，有可能成為腫瘤診斷的重要指標，同時，也可能成為腫瘤治療的新靶點。

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Studies on promoting cellular senescence by VPA combined with ATRA in cervical cancer cells

You Qingye1，Feng Dingqing2，Ling Bin1，3，et al（1Dept of Obstetrics and Gynecology，2Key Laboratory of Molecular Medicine，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；
3Dept of Obstetrics and Gynecology of China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100086）

ObjectiveTo study valproate acid（VPA）combined with all-trans retinoic acid（ATRA）induced cervical cancer cells senescence，and explore its mechanism.MethodsThe experiment is divided into the control group，the VPA group，ATRA and VPA＋ATRA groups.HeLa and SiHa cells were treated with combinated use of 3 mmol／L VPA，1 μmol／L ATRA or respectively.The control group was treated with vehicle only.Using CellTiter 96?Aqueous cell proliferation assay to detect the inhibitory rate of proliferation.Apply β-galactosidase staining method to observe the senescence.The mRNA expressions of P16，P63 and hTERT were detected using Q-PCR and its protein expressions were determined using Western blot.ResultsThe proliferation of HeLa and SiHa cells were significantly inhibited by VPA.The effect of VPA combinated with ATRA was stronger than individual treatment（P＜0.05）.β-galactosidase staining showed that β-galactosidase staining rate was up-regulated after VPA combined with ATRA in cervical cancer HeLa and SiHa cells，the difference was significant compared with control group and individual group（P＜0.05）.Q-PCR and Western blot showed that VPA enhanced the mRNA and protein expression of P16，P63 and reduced the expression of hTERT.The efficacy was more powerful in combination therapy group（P＜0.05）.ConclusionVPA combined with ATRA can inhibit the growth of cervical cancer cell lines.The effect of inducing cervical cancer cells senescence may be related with up-regulation of P16，P63 and downregulation of hTERT.

cervical cancer；valproic acid；tretinoin；cell senescence

R 737.33

1000－1492（2015）02－0135－05

2014－11－03接收

國家自然科學基金（編號：81372777、81372779、81072127）

安徽醫科大學附屬省立醫院1婦產科、2分子醫學重點實驗室，合肥 2300013衛生部中日友好醫院婦產科，北京 100086

尤青葉，女，碩士研究生；凌 斌，男，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：lingbin.ling＠gmail.com