青春期低劑量氰戊菊酯暴露對小鼠行為的影響

代 波，趙瑩瑩，王 博，王 華，張 程，徐德祥，孟秀紅

◇預防醫學研究◇

青春期低劑量氰戊菊酯暴露對小鼠行為的影響

代 波1，趙瑩瑩1，王 博1，王 華2，張 程2，徐德祥2，孟秀紅1

目的 探究青春期低劑量氰戊菊酯暴露對小鼠行為的影響。方法 對出生后第28天的48只ICR小鼠雌雄各半分別進行不同濃度氰戊菊酯（0、0.02、0.20、2.00 mg／kg）灌胃染毒。出生后第28～56天。在出生后第9周，雌雄小鼠分別進行相關行為學實驗。通過黑白巷實驗、曠場實驗檢測小鼠的探索行為和焦慮相關行為，采用Morris水迷宮實驗檢測小鼠的空間學習和記憶相關行為。結果 各組小鼠在曠場實驗中的行為差異無統計學意義。在黑白巷實驗中，與0 mg／kg組雄性小鼠比較，0.02 mg／kg組和2.00 mg／kg組雄性小鼠跨過中線的潛伏期明顯延長（P＝0.006，P＝0.039）。在Morris水迷宮的定位航行實驗中，與0 mg／kg組雌鼠比較，0.02 mg／kg組和2.00 mg／kg組的雌鼠登陸平臺的潛伏期明顯延長（P＝0.011，P＝0.014）；與0 mg／kg組雌鼠比較，0.20 mg／kg組的雌鼠搜尋平臺的距離明顯增加（P＝0.003）；而雄性小鼠各組指標之間差異無統計學意義。在Morris水迷宮的空間探索實驗中，與0 mg／kg組比較，0.20 mg／kg組雌鼠的目標象限時間比降低（P＝0.046）；而雄鼠各組指標之間的差異無統計學意義。結論 青春期低劑量的氰戊菊酯暴露能夠影響小鼠的多種行為，可能影響小鼠青春期的神經行為發育。

青春期；低劑量；氰戊菊酯；行為；學習記憶

氰戊菊酯是一種II型擬除蟲菊酯類農藥，廣泛應用于蔬菜、果樹、棉花等農作物的害蟲防治。兒童主要通過飲食、粉塵、住宅的地面等途徑接觸到低水平的擬除蟲菊酯類農藥，研究對象中大多數兒童至少接觸了1種擬除蟲菊酯類農藥［1］。擬除蟲菊酯為脂溶性，可以通過胎盤屏障進入胎兒體內，也可以在哺乳期通過乳汁被幼兒攝入，對子代造成影響。母親懷孕期間擬除蟲菊酯類農藥的暴露導致嬰兒的神經智力發育水平降低［2］。尿中擬除蟲菊酯類農藥的代謝產物濃度較高的兒童SDQ量表中總困難的得分越高［3］。擬除蟲菊酯類農藥及其代謝產物能夠產生抗雌激素和抗雄激素作用，而且對甲狀腺激素受體產生拮抗作用［4］。青春期氰戊菊酯的暴露導致雄性小鼠大腦皮層中睪酮和雌二醇水平下降，而雌性小鼠中睪酮和雌二醇的水平略微上升［5］。Moniz et al［6］發現圍生期氰戊菊酯暴露使子代大鼠性成熟推遲、性行為減少、發情周期異常，這些結果表明氰戊菊酯具有抗雌激素的作用。該研究通過建立青春期低劑量氰戊菊酯暴露的小鼠動物模型，觀察氰戊菊酯對小鼠在曠場實驗、黑白巷實驗、Morris水迷宮實驗中焦慮、學習記憶等行為的影響，探討氰戊菊酯對神經行為發育的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物出生后第21天清潔級ICR小鼠共48只，8～11 g，雌雄各半，購于安徽省實驗動物中心。雌鼠和雄鼠分籠飼養，飼養環境為晝夜12 h交替，溫度控制在20～25℃，濕度控制在50%～60%。小鼠適應環境1周后，在出生后第28天將小鼠按性別分為雌雄2組，再將每個性別小鼠隨機分為4個不同濃度的暴露組（0、0.02、0.20、2.00 mg／kg），每組6只。每天同一時間對各組小鼠進行灌胃，灌胃的試劑體積為小鼠體重的1%。出生后第56天進行行為學實驗，行為實驗的順序依次為曠場實驗、黑白巷實驗、Morris水迷宮。

1.2 主要試劑與器材氰戊菊酯及其他生化試劑均購自美國Sigma公司；玉米油為福臨門玉米油；Morris水迷宮實驗設備采用安徽醫科大學藥學院ANY-maze動物行為分析系統，購自上海欣軟信息科技有限公司；曠場行為實驗及黑白巷行為實驗的設備均為自制。

1.3 行為實驗采用曠場實驗、黑白巷實驗檢測小鼠的探索和焦慮相關行為，Morris水迷宮測試小鼠青春期的空間學習和記憶能力。曠場實驗時間：出生后第57天，記錄小鼠在曠場中的跑動格數，用于反應小鼠的自發活動能力，站立次數反應小鼠的探究新異環境的能力，第1格潛伏期、周邊時間用于反應焦慮行為。黑白巷實驗時間：出生后第58天，記錄潛伏期、跨越次數和黑巷內時間，反應小鼠的焦慮行為。Morris水迷宮實驗時間：出生后第60天，記錄登臺潛伏期、游泳距離、目標象限時間比、平臺區穿越次數。Morris實驗分為兩個部分：前6 d的定位航行實驗反應小鼠的學習能力，第7天的空間探索實驗反應小鼠的記憶能力。

1.4 統計學處理使用SPSS 10.0對數據進行分析，測定值用±s表示。Morris水迷宮的定位航行實驗數據的統計采用重復測量的方差分析，其他行為數據采用單因素的方差分析。處理組之間的兩兩比較采用事后檢驗中的最小顯著差法。

2 結果

2.1 體重本研究中小鼠出生后第28～56天每日經口給予不同濃度氰戊菊酯（0、0.02、0.20、2.00 mg／kg）暴露，各組小鼠體重在各觀察時間點差異無統計學意義。

2.2 曠場實驗青春期低劑量氰戊菊酯的暴露對雄性和雌性小鼠在曠場實驗中站立次數、潛伏期、周邊區域活動時間、跨越的方格數等指標的影響差異無統計學意義。見表1。

表1 青春期氰戊菊酯暴露對小鼠曠場行為的影響（n＝6，±s）

表1 青春期氰戊菊酯暴露對小鼠曠場行為的影響（n＝6，±s）

2.3 黑白巷實驗不同組間雄鼠的潛伏期差異有統計學意義（F＝4.764，P＝0.015），其中與0 mg／kg組比較，0.02 mg／kg組雄鼠的潛伏期明顯升高（P＝0.006）；不同組間雌鼠的潛伏期差異有統計學意義（F＝3.824，P＝0.031），其中與0 mg／kg組比較，2.00 mg／kg組雌鼠的潛伏期明顯升高（P＝0.039）。不同組間雄鼠和雌鼠的白巷時間、跨越中線次數差異無統計學意義。見表2。

2.4 Morris水迷宮實驗

2.4.1定位航行試驗 持續6 d的定位航行實驗中，各組小鼠的登臺潛伏期隨著實驗天數增加逐漸降低。見圖1。雌鼠各組游泳距離差異有統計學意義（F＝4.638，P＝0.016）。與0 mg／kg組比較，0.20 mg／kg組游泳距離顯著增加，差異有統計學意義（P＝0.003）。雌鼠各組登臺潛伏期差異有統計學意義（F＝3.627，P＝0.036）。與0 mg／kg組比較，0.20 mg／kg組和2.00 mg／kg組潛伏期顯著延長，差異有統計學意義（P＝0.011，P＝0.014）。不同組雌鼠的目標象限時間比差異無統計學意義。雄鼠各組游泳距離、登臺潛伏期、目標象限時間比等指標差異均無統計學意義。見表3。

表2 青春期氰戊菊酯暴露對小鼠黑白巷行為的影響（n＝6，±s）

表2 青春期氰戊菊酯暴露對小鼠黑白巷行為的影響（n＝6，±s）

與同一性別小鼠0 mg／kg組比較：*P＜0.05

表3 青春期氰戊菊酯暴露對小鼠Morris水迷宮實驗空間學習能力的影響（n＝6，±s）

表3 青春期氰戊菊酯暴露對小鼠Morris水迷宮實驗空間學習能力的影響（n＝6，±s）

與0 mg／kg組雌鼠比較：*P＜0.05

2.4.2 空間探索實驗雌鼠各組目標象限區域活動時間占總時間的比值差異有統計學意義（F＝5.023，P＝0.012），與0 mg／kg組比較，0.20 mg／kg組目標象限時間比明顯減少，差異有統計學意義（P＝0.046）；而各組雌鼠穿越平臺區域的次數差異無統計學意義。雄鼠各組的目標象限時間比、穿越次數等指標差異均無統計學意義。見表4。

表4 青春期暴露氰戊菊酯對小鼠Morris水迷宮空間記憶能力的影響（n＝6，±s）

表4 青春期暴露氰戊菊酯對小鼠Morris水迷宮空間記憶能力的影響（n＝6，±s）

與0 mg／kg組雌鼠比較：*P＜0.05

3 討論

本實驗對青春期小鼠采用低劑量氰戊菊酯經口灌胃染毒，觀察低劑量暴露氰戊菊酯對小鼠神經行為發育的影響，0.02 mg／kg相當于國際食品法典委員會規定的氰戊菊酯每日允許攝入量，2.00 mg／kg相當于1／100 LD50，低于此前研究［5，7］設計的劑量組30 mg／kg（1／8 LD50）和7.5 mg／kg（1／32 LD50）。

在Morris水迷宮定位航行實驗中，各實驗組的仔鼠登臺潛伏期隨著實驗天數的增加逐漸縮短，說明各組小鼠通過訓練均能找到平臺，而且雌性小鼠0.20 mg／kg組和2.00 mg／kg組的潛伏期與0 mg／kg組比較潛伏期明顯延長。各組小鼠的游泳路程也隨著實驗天數的增加而減少，0.20 mg／kg組雌鼠的游泳路程與0 mg／kg組游泳路程相比有明顯增加的趨勢，青春期氰戊菊酯暴露對雌性小鼠的空間學習能力有影響。研究［7］表明，青春期氰戊菊酯暴露對雌雄小鼠的影響存在性別差異，雌鼠相比雄鼠在空間學習和記憶方面受到的損傷要更加嚴重，青春期的暴露還抑制了雄鼠的攻擊行為，增加了雌鼠的焦慮行為。Morris水迷宮空間探索實驗中，雌鼠各組的目標象限時間比差異有統計學意義，0.20 mg／kg組的雌鼠與0 mg／kg組比較目標象限時間比明顯減少，說明0.20 mg／kg組雌鼠在目標象限中的時間相對較少。研究［8］表明，仔鼠的軀體感覺運動功能發育受到了氰戊菊酯暴露的影響，而到了青春期，小鼠的感覺運動功能又得以恢復；小鼠成年后的空間記憶能力也受到了影響。有研究［9］顯示，青春期暴露氰戊菊酯的小鼠在Y迷宮實驗中表現出學習記憶能力的損傷。

在曠場實驗中，青春期氰戊菊酯暴露對于雌雄小鼠在曠場實驗的穿越格數、周邊時間、潛伏期等指標的影響差異無統計學意義。在黑白巷實驗中，雌雄小鼠的白巷時間、跨越次數等指標各組之間差異無統計學意義，而氰戊菊酯暴露組的雌雄小鼠與0.20 mg／kg組比較潛伏期增加了。有研究［10］表明，哺乳期氰戊菊酯暴露導致了子代雌性大鼠在青春期探索和運動協調能力降低、焦慮行為增加，對挖掘、囤積食物、筑巢等生活習性沒有影響。

許多內分泌干擾物的暴露都能影響神經行為發育。除了本研究中的氰戊菊酯，BPA、鄰苯二甲酸酯、溴氰菊酯等農藥均可能影響到小鼠的焦慮抑郁等行為及學習記憶能力［11－14］。氰戊菊酯暴露對神經行為的影響可能是通過干擾發育大腦中雌激素及其受體的正常功能和抑制神經元突起等途徑實現的［5，15］。

綜上所述，青春期低劑量氰戊菊酯暴露對小鼠青春期神經行為發育存在影響。

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Effects of pubertal exposure to low dose fenvalerate on behaviors in mice

Dai Bo，Zhao Yingying，Wang Bo，et al
（Dept of Maternal，Child Adolescent Health，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo explore the effects of low dose of fenvalerate exposure during puberty on behaviors in mice.MethodsTwenty four male and twenty four female ICR mice in postnatal day 28 were randomly divided into four groups respectively：the control group（0 mg／kg）and fenvalerate group，0.02，0.20，2.00 mg／kg.Mice were treated with corn oil as a vehicle control or fenvalerate by gavage daily from postnatal day 28 to 56.At the age of 9 weeks，open field，black and white alley，Morris water maze were used to test anxiety，exploratory behavior，spatial learning and memory in mice.ResultsExposure to fenvalerate did not alter mice behaviors in open field test.In black and white alley test，pubertal exposure to fenvalerate（0.02 mg／kg）significantly increased latency in male mice（P＝0.006）；exposure to fenvalerate（2.00 mg／kg）significantly increased latency in female mice（P＝0.039）.TheResultsof spatial learning test in Morris water maze showed that pubertal exposure to fenvalerate（0.20 mg／kg and 2.00 mg／kg）significantly increased the escape latency of female mice（P＝0.011，P＝0.014）；exposure to fenvalerate（0.20 mg／kg）significantly extended the escape distance in the female（P＝0.003）.Spatial memory testResultsshowed that the time proportion of objective quadrant was significantly decreased in female mice treated with 0.20 mg／kg（P＝0.046）.Exposure to fenvalerate did not alter behaviors of male mice in Morris water maze test.ConclusionPubertal exposure to low dose fenvalerate disrupts multiple behaviors and may affect neurobehavioral development in mice.

puberty；low dose；fenvalerate；behaviors；learning and memory

R 977.12；R 179；R 322.811

1000－1492（2015）02－0177－04

2014－10－23接收

安徽省自然科學基金（編號：KJ2010A173）；國家自然科學基金（編號：81102155）；安徽醫科大學博士科研課題資助（編號：XJ201115）

安徽醫科大學公共衛生學院1兒少與衛生保健學系、2衛生毒理學系，合肥 230032

代 波，男，碩士研究生；孟秀紅，女，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：mengxh＿ahmu＠163.com