酒精性脂肪肝中庫普弗細胞表型變化的探討

程 希，胡超杰，李晚霞，黃 成，李 俊

酒精性脂肪肝中庫普弗細胞表型變化的探討

程 希1，2，3，胡超杰1，2，3，李晚霞1，2，3，黃 成1，2，3，李 俊1，2，3

目的通過建立小鼠酒精性脂肪肝（AFL）的模型，并采用肝臟原位灌流，分離出形態良好、具有生物學活性的庫普弗細胞（KCs），研究其在AFL中的作用。方法采用Lieber-DeCarli液體飲食加一次急性酒精灌胃，建立小鼠AFL模型。造模周期為16 d，于第16天灌胃9 h后處死小鼠，取小鼠肝臟、血清及KCs。檢測各組血清谷丙轉氨酶／谷草轉氨酶（ALT／AST）、肝勻漿、血清中總膽固醇／三酰甘油（TG／TC）水平變化和肝臟病理切片HE、油紅染色。選取原位灌流的方法分離KCs，采用流式細胞術分析KCs表型及組成的改變。熒光實時定量PCR（qRT-PCR）檢測組織及提取細胞中各細胞因子水平。結果ALT／AST、TG／TC等反應肝損傷的指標模型組顯著高于對照組，HE及油紅染色結果與之一致，表明小鼠AFL模型建立成功。肝臟原位灌流每只小鼠細胞得率約1.5×106～2.0×106個。以小鼠巨噬細胞表面標記分子F4／80及白細胞共同抗原CD45雙標設門，流式細胞術分析F4／80和CD45雙陽性細胞，在模型中肝臟固有CD68＋細胞顯著降低，并出現大量的浸潤單核細胞。qRTPCR結果顯示，在肝組織及原代KCs中細胞因子，腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白（MCP-1）水平顯著升高。結論 小鼠AFL模型建立成功，肝臟原位灌流法細胞得率較高，AFL的發病可能與KCs構成、表型改變，與細胞因子升高介導外周單核細胞浸潤有關。

酒精性脂肪肝；原位灌流；庫普弗細胞；細胞因子

酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是全球發病率和死亡率較高的慢性肝病。文獻［1－2］報道，大部分的酗酒者都會形成脂肪肝，其中有20%～40%會發展為更嚴重的ALD。飲酒所造成酒精性肝損傷比較顯著［3］。然而，飲酒如何影響ALD進展的機制尚不明確。庫普弗細胞（kupffer cells，KCs）作為肝臟內定居的巨噬細胞主要功能是清除病原體，產生各種促炎因子［4］，其在酒精性脂肪肝（alcoholic fatty liver，AFL）發病過程中起到了非常重要的作用。一方面，血液中的酒精能夠刺激KCs；另一方面，內毒素也能夠刺激KCs活化，釋放細胞因子及氧自由基。文獻［5－7］報道，KCs可以分為炎性浸潤（CD11b＋）與組織固有（CD68＋）兩群，共同參與機體炎癥和疾病的調控。CD11b＋主要功能是分泌各種細胞因子，CD68＋主要功能則是修復和吞噬［8］。KCs在疾病發展中的作用不同，且在AFL中這兩群細胞是如何變化還鮮少有報道。該研究建立AFL模型，提取原代KCs，旨探討CD11b＋與CD68＋兩群細胞和AFL發病的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康的40只C57BL／6雄性小鼠，清潔級，9～10周齡（體重≥20 g），由安徽醫科大學實驗動物中心提供。飼養于安徽醫科大學藥學院動物房。

1.2 試劑標準型Lieber-DeCarli酒精液體飼料和匹配的對照液體飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司）；丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒、天冬氨酸氨基轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測試盒（南京建成生物工程研究所）；總膽固醇／三酰甘油（total cholesterol／triglycerides，TG／TC）（長春匯力生物技術有限公司）；Ⅳ型膠原酶、蛋白酶E、Percoll、DNA酶Ⅰ（美國Sigma公司）；流式抗體Anti-Mouse F4／80 Antigen FITC、Anti-MouseCD11bPerCP-Cy5.5、Anti-MouseCD16／CD32、Anti-Mouse CD68 PE（美國Biolegend公司）。

1.3 儀器FA2004A電子天平（上海精天電子儀器廠）；BT002100M型蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；Napco 26100型CO2培養箱（美國杜邦公司）；低速冷凍離心機（美國貝克曼公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）；超凈臺（蘇州凈化有限公司）；FACS CantoⅡ流式細胞儀（美國BD公司）。

1.4 方法

1.4.1動物模型的建立與處理 C57BL／6小鼠40只，隨機分為正常組和模型組。模型組喂食Lieber-DeCarli酒精液體飼料，含67.4 ml／L的無水乙醇（藥用級），對照組喂匹配的對照液體飼料。每只小鼠喂食30 ml／d。于第16天上午7～9 h酒精灌胃，9 h后處死取肝臟標本。小鼠取血后靜置，3 000 r／min離心20 min，收集血清。按試劑盒說明檢測ALT／AST、TG／TC含量。油紅染色觀察肝組織中脂肪沉積，HE染色觀察肝臟病變程度。

1.5 KCs的提取

1.5.1灌流液的配制 灌注緩沖液濃縮液（perfusion buffer concentrate，PBC）（NaCl 103.75 g，KCl 6.25 g，Hepes 28.7 g，水350 ml＋4%NaOH溶液75 ml加水至終體積為500 ml）；灌注緩沖液（perfusion buffer，PB）（稀釋40 ml已提前配好的PBC至1 L）；保存緩沖液（含1%牛血清蛋白PB）；酶液（加1 ml 5.474%CaCl2溶液至99 ml PB中，用前再加入膠原酶Ⅳ和蛋白酶E各35 mg）；“100%”Percoll（Percoll原液13.5 ml＋10×PBS 1.5 ml），50%Percoll（100%Percoll 10 ml＋1×PBS 10 ml），25%Percoll（100%Percoll 5 ml＋1×PBS 15 ml）。

1.5.2 肝臟灌流及細胞離心 水合氯醛（1%）麻醉小鼠、固定，小鼠背部用紙卷墊住，打開腹腔暴露肝臟，游離出門靜脈和下腔靜脈，穿線。從門靜脈插入針頭，確保針頭與血管平行，結扎。剪斷下腔靜脈，調大灌流泵流速。待肝臟變白，將灌流液換成0.035%酶液，一般25～30 ml，消化至肝臟表面有裂紋時，游離肝臟、撕碎、過濾后離心。4℃，697 r／min離心2 min，重復離心后取上清液；換3 487 r／min離心10 min，棄上清液，用25%的Percoll重懸，鋪于50%的Percoll上；4℃，3 487 r／min離心30 min。離心結束后，吸取兩層不同濃度Percoll中間的液體至于50 ml離心管中，加入PBS重懸，4℃，3 487 r／min離心10 min。棄上清液，并在沉淀中加入10 ml培養基。重懸后，待檢測。

1.6 流式細胞術檢測細胞得率和比例取灌流所得細胞，離心后用少量生理鹽水重懸，加入到流式管中，用抗小鼠CD16／CD32包被細胞，避光孵育15 min后，標記F4／80、CD45、CD68及CD11b流式抗體，孵育15 min后對各細胞群進行檢測。

1.7 熒光實時定量PCR（florescent real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測肝組織和細胞中各細胞因子mRNA表達水平應用TRIzol試劑盒提取肝組織及原代提取KCs中總RNA，通過分光光度法測定RNA溶液的吸光度（optical density，OD）來測定RNA的含量和純度（OD260／OD280＞1.8）逆轉錄成cDNA后，用qRT-PCR儀檢測其中各細胞因子的mRNA表達水平。IL-6上游引物：5′-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3′，下游引物：5′-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3′；TNF-α上游引物：5′-TGTCCCTTTCACTCACTGGC-3′，下游引物：5′-CATCTTTTGGGGGAGTGCCT-3′；磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydro genase，GAPDH）上游引物：5′-GGACCTCATGGCCTACATGG-3′，下游引物：5′-TAGGGCCTCTCTTGCTCAGT-3′；轉錄生長因子（transforming growth factor，TGF-β）上游引物：5′-GGACTCTCCACCTGCAAGAC-3′，下游引物：5′-CTGGCGAGCCTTAGTTTGGA-3′；白介素-10（interleukin-10，IL-10）引游引物：5′-GCTGCCTGCTCTTACTGACT-3′，下游引物：5′-CTGGGAAGTGGGTGCAGTTA-3′；單核細胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）上游引物：5′-TCAGCCAGATGCAGTTAACGC-3′，下游引物：5′-TGATCCTCTTGTAGCTCTCCAGC-3′。

1.8 統計學處理采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 小鼠肝體比、肝勻漿及血清中TC、TG水平變化 造模完成后分別稱取對照組和模型組的小鼠體重、肝重，計算小鼠肝體比。模型組肝體比明顯高于對照組，提示肝臟有病變，差異有統計學意義（P＜0.01）。造模完成后，收集肝組織及血清。檢測肝勻漿（肝組織勻漿后收集的上清液）及血清中TC、TG水平。模型組肝勻漿血清中TC、TG水平明顯高于對照組，差異有統計學意義（t＝4.144，P＜0.01），見表1。

表1 小鼠肝臟體重比、肝勻漿、血清中TC／TG水平（±s，n＝40）

表1 小鼠肝臟體重比、肝勻漿、血清中TC／TG水平（±s，n＝40）

與對照組比較：**P＜0.01

2.2 小鼠血清ALT、AST變化檢測血清中酶的活性的改變可以反映肝臟的功能情況，當肝細胞受損時，肝細胞內的ALT、AST釋放入血，血清ALT、AST活性會升高。因此，這兩種酶的活性升高成為肝功能受損的特異性指標。結果顯示，模型組較對照組血清ALT、AST水平明顯升高，差異有統計學意義（t＝6.055，P＜0.01），見圖1。

2.3 肝臟油紅染色及HE染色取小鼠肝組織，用OCT冰凍包埋劑包埋，－80℃保存。切片后油紅染色，蘇木精復染；藍色部分為細胞核，紅色部分為脂肪。對照組油紅染切片中基本不見紅色脂肪組織部分，而模型組中可見大量紅色脂肪組織，提示肝臟脂肪病變明顯，造模成功。HE染色結果顯示，正常組肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊；模型組肝臟可見明顯脂肪空泡，肝臟結構紊亂。見圖2。

2.4 流式細胞術檢測CD11b＋、CD68＋兩群細胞比例用小鼠巨噬細胞表面標記分子F4／80及白細胞共同抗原標記分子CD45雙標提取的原代KCs，方框中為F4／80＋和CD45＋。流式細胞術結果顯示，模型組中KCs比例明顯減少。選取對照組和模型組中F4／80、CD45雙陽性的細胞分析。對照組CD11b＋CD68＋的細胞占全部巨噬細胞的90.1%，模型組雙陽性的細胞占53.7%，同時存在CD11b＋CD68－細胞，比例約45.2%。見圖3。

2.5 肝組織及原代KCs細胞因子mRNA表達水平收集肝組織及原代提取KCs，提取各自mRNA，采用qRT-PCR檢測對照組和模型組中各細胞因子mRNA表達水平。肝組織中TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA的表達水平均有明顯升高，其中MCP-1的升高顯著（P＜0.01）。在原代提取的KCs中，TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA的表達水平也都有升高，且MCP-1 mRNA的水平也升高（P＜0.01）。而IL-10、TGF-β的mRNA表達水平則有少量降低或者無明顯變化。見圖4。

3 討論

采用Lieber-DeCarli液體飼料造模，因其在造模過程中由小鼠自行取食，建立小鼠AFL模型較傳統連續灌胃6周的AFL模型［8］更加方便、易行，造成的AFL模型比較明顯，并且這種模型與長期飲酒造成的肝臟疾病患者很相似。實驗中反映肝損傷的指標肝體比、TG／TC、ALT／AST的水平，在造模16 d時，模型組明顯高于對照組。同時，油紅及HE染色中模型組可見明顯脂肪沉積和空泡，組織疏松。通過在經典的KCs提取的方法［9－10］上進行了改進：一方面在操作過程中，減少了酶的用量，節約了試劑；并且在實際操作中發現，可將方法中分離后再消化的步驟省略，僅需在體灌注即可獲得很好的消化結果。另一方面，將3層的密度梯度離心中將細胞懸液鋪于25%的Percoll后再鋪于50%的Percoll上，改進為將細胞直接與25%的Percoll混勻后鋪于50%的Percoll上，將3層梯度離心改為3層，離心過后可見明顯的3層分層，吸取中間層，可明顯提高細胞得率。

KCs發育來源于骨髓，在炎癥和防御的過程中起重要作用，在組織中可根據對環境的應答獲得不同的功能表型。文獻［5］報道，在正常與病理狀態下，KCs中CD68＋及CD11b＋這兩群的比例功能并不完全相同。流式細胞術結果顯示，通過原位灌流提取KCs，AFL模型中F4／80＋與CD45＋細胞，以及各自CD68＋、CD11b＋兩群細胞比例較對照組發生了很大變化，與文獻［6］報道一致。兩組共表達F4／80＋和CD45＋細胞提示，在正常情況下，CD68＋的肝臟巨噬細胞占到了絕大多數，達90.1%；而在AFL模型中，CD68＋的細胞減少至53.7%，CD68－細胞則明顯上升，這群CD68－細胞主要為浸潤的單核細胞。

肝組織qRT-PCR結果顯示，在模型中促炎的細胞因子，例如TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA表達水平明顯升高，提示酒精刺激可引起機體的炎癥反應。同時，原代提取KCs的qRT-PCR結果表明在AFL模型中，KCs分泌促炎因子，例如TNF-α、IL-6、MCP-1mRNA的水平明顯升高；而相對抑炎的細胞因子如IL-10、TGF-β的mRNA表達水平就有少量降低或無明顯變化。肝組織、原代KCs中MCP-1 mRNA的水平均有顯著升高，作為誘導單核細胞浸潤的細胞因子，其升高可能與模型中CD11b＋及CD68＋細胞增加有關。本研究顯示，AFL模型中CD68＋這群細胞可能在進行吞噬和修復功能后自身發生了凋亡，也有可能是在疾病的發展過程中MCP-1等促炎因子分泌增加介導外周單核浸潤，但還未來得及轉化為巨噬細胞，因而僅表現為CD11b＋、CD68－。

綜上所述，CD68及CD11b兩群的比例改變以及各自不同的功能在AFL的疾病過程中起到了非常重要的作用。然而AFL的發病具體機制，尚待進一步研究。

［1］ Gao B，Bataller R.Alcoholic liver disease：pathogenesis and new therapeutic targets［J］.Gastroenterology，2011，141（5）：1572－85.

［2］ 朱仁敏，張 程，陳 熙，等.Kupffer細胞在果糖引起的非酒精性脂肪肝中的作用［J］.安徽醫科大學學報，2012，47（3）：257－60.

［3］ Lachenmeier D W，Monakhova Y B，Rehm J.Influence of unrecorded alcohol consumption on liver cirrhosis mortality［J］.World J Gastroenterol，2014，20（23）：7217－22.

［4］ 黃 艷，黃 成，李 俊.肝纖維化病程中Kupffer細胞分泌的細胞因子對肝星狀細胞活化增殖、凋亡的調控［J］.中國藥理學通報，2010，26（1）：9－13.

［5］ Davies L C，Rosas M，Jenkins S J，et al.Distinct bone marrowderived and tissue-resident macrophage lineages proliferate at key stages during inflammation［J］.Nat Commun，2013，4：1886.

［6］ Ikarashi M，Nakashima H，Kinoshita M，et al.Distinct development and functions of resident and recruited liver Kupffer cells／macrophages［J］.J Leukoc Biol，2013，94（6）：1325－36.

［7］ Zimmermann H W，Trautwein C，Tacke F.Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury［J］.Front Physiol，2012，3：56.

［8］ Ramachandran P，Pellicoro A，Vernon M A，et al.Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype，which orchestrates the regression of murine liver fibrosis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109（46）：E3186－95.

［9］ 張勁松，吳 鐵，鄒麗宜.小鼠酒精性脂肪肝模型的建立［J］.中外健康文摘，2011，8（30）：96－8.

［10］朱榮濤，魏思東，李培志，等.小鼠Kupffer細胞分離及細胞培養［J］.醫學分子生物學雜志，2011，8（6）：484－8.

The study of kupffer cells phenotypic changes in alcoholic fatty liver

Cheng Xi1，2，3，Hu Chaojie1，2，3，Li Wanxia1，2，3，et al
（1School of Pharmacology，2Institute for Liver Diseases of Anhui Medical University，Hefei 230032；3Anhui Innovative Drug Research Institute of Industry Common，Hefei 230032）

ObjectiveEstablish the model of alcoholic fatty liver in mice and isolate the biological activity kupffer cells（KCs），in order to study its role in the alcoholic fatty liver disease.MethodsC57BL／6 mice were fed with the Lieber-DeCarli diet for 16 days plus one time of acute alcohol lavage，to establish the model of alcoholic fatty liver.Tissue specimens were collected on the sixteenth day after gastric lavage 9 h later.To verify whether the model was established successfully by detecting the level of serum alanine aminotransferase／glutamic oxalacetic transaminase（ALT／AST）and total cholesterol／triglycerides（TG／TC），the level of TG／TC of liver tissue homogenate and liver pathological section HE and oil red staining.KCs were isolated by in situ perfusion，and the cell yield and cell changes were detected by flow cytometry.Cytokine levels of organization and the primary cell were detected by qRT-PCR.ResultsThe model response to liver injury index of ALT／AST was higher than that of control group，meanwhile HE and oil red stainingResultswere consistent with that.So the alcoholic fatty liver model was successfully established in mice.Cell yield of each mouse was about 1.5×106～2.0×106，KCs were doublelabeled by murine macrophage cell surface marker F4／80 molecule and white blood cells surface antigen molecules CD45，F4／80 and CD45 double positive cells were selected to flow analysis.Data showed that natural CD68＋was significantly lower in the model，a large number of the infiltration of mononuclear cells were elevated.Florescent real-time quantitative RT-PCR（qRT-PCR）Resultsshowed that cytokine，tumor necrosis factor（TNF-α），interleukin-6（IL-6），monocyte chemoattractant protein（MCP-1）level increased significantly in liver tissue and primary cell.ConclusionThe model of alcoholic fatty liver is successfully established and there is a high yield of cells in situ perfusion.The incidence of alcoholic fatty liver may be relative to hepatic macrophages constitute and phenotypic changes，associated with elevated cytokine mediated infiltration of peripheral mononuclear cells.

alcoholic fatty liver；in situ perfusion；kupffer cells；cytokines

R 967；R 965.2

1000－1492（2015）02－0149－05

2014－10－15接收

國家自然科學基金（編號：81273526）；安徽省教育廳基金項目（編號：KJ2012A156）；安徽省自然科學基金（編號：1308085MH145）；安徽醫科大學博士科研啟動基金（編號：XJ201118）

安徽醫科大學1藥學院、2肝病研究所，合肥 2300323安徽省創新藥物產業共性研究院，合肥 230032

程 希，女，碩士研究生；李 俊，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lj＠ahmu.edu.cn