腦膠質瘤癌組織與外周血中p16甲基化檢測及臨床意義

鄧鵬程，徐培坤，朱立新，王 斌，楊成子

◇經驗與體會◇

腦膠質瘤癌組織與外周血中p16甲基化檢測及臨床意義

鄧鵬程1，徐培坤1，朱立新2，王 斌1，楊成子1

選擇48例腦膠質瘤患者血漿及癌組織作為實驗組，10例腦外傷患者壞死腦組織、血漿及10例健康者血漿作為對照組。應用甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP）和亞硫酸氫鹽處理后測序（BSP）法檢測p16基因甲基化，顯示實驗組外周血漿、腫瘤組織中p16基因甲基化率分別為37.5%（18／48）、43.8%（21／48），對照組均未發現甲基化現象。實驗組基因甲基化與臨床資料差異無統計學意義。

膠質瘤；甲基化；p16；血漿；癌組織

p16基因位于9p21，包括3個外顯子和2個內含子，是常見的抑癌基因，能夠調節細胞的異常增殖［1］。p16基因處于甲基化狀態則無法發揮其正常功能。該實驗通過對48例膠質瘤患者的血漿標本和癌組織標本p16基因甲基化的檢測，分析p16基因甲基化狀態與膠質瘤的聯系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2013年3月～2014年7月于安徽醫科大學第一附屬醫院神經外科手術中48例腦膠質瘤患者的癌組織及對應血漿標本作為實驗組，其中男27例，女21例；年齡7～74歲，中位年齡43.5歲。癌組織標本均經我院病理科確診：星形細胞瘤16例，少枝膠質細胞瘤9例，髓母細胞瘤5例，中樞神經細胞瘤1例，膠質母細胞瘤14例，室管膜瘤3例。其中Ⅰ～Ⅱ級26例，Ⅲ～Ⅳ級22例。腦膠質瘤患者術前均未進行放、化療等前期治療，可排除前期治療干擾實驗結果。另取10例因腦外傷手術患者的壞死腦組織及對應血漿標本和10例健康者血漿標本作為對照組，其中男13例，女7例，年齡20～67歲，中位年齡為45歲。腦組織及血

漿標本提取后快速轉放入－80℃冰箱中冷凍備用。

1.2 方法

1.2.1標本DNA提取和DNA濃度、純度測定 ①

取癌組織標本10 mg移至加入冰水浴預冷的研缽中，快速充分研磨成勻漿；血漿標本取樣200 μl；②使用AxyPrep基因組DNA試劑盒，根據說明書按步驟提取標本DNA并檢測提取的DNA濃度和純度；③將提取癌組織及對應血漿標本的DNA標號后移至－20℃冰箱保存。

1.2.2 基因組樣本的亞硫酸氫鈉處理 ①準備DNA樣品，總體積為20 μl，總量約500 ng（以200～500 ng最佳）；②采用MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit試劑盒，按使用說明進行亞硫酸鹽修飾；③將修飾后的DNA轉入1.5 ml的離心管中進行下一步實驗操作。

1.2.3修飾后DNA樣本PCR擴增 p16基因甲基化和非甲基化引物由上海Invitrogen公司設計（甲基化的引物F：5′-TCGTCGTTGTGGTTTTCGTG-3′，R：5′-AAACCTCCACCGACGATTATCT-3′；非甲基化的引物F：5′-GGGGTGTTTGTTGTTGTGGT-3′，R：5′-ATCTCCTCCTCCTCCTAACCTA-3′）。PCR反應體系為25 μl（Buffer 2.5 μl＋Mg 1 μl＋F1／R1 1 μl＋10 mmol／L dNTP 0.5 μl＋Bisulfite）處理的DNA 1.0 μl＋DNA聚合酶0.2 μl＋ddH2O 19 μl。PCR循環參數：95℃預變性300 s，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環35周期，72℃延伸300 s后終止擴增。PCR擴增的目的產物經純化后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4PCR產物TA克隆測序 步驟一：提取標本DNA，亞硫酸氫鈉處理，PCR步驟如前。其中引物由上海Invitrogen公司設計合成（p16基因引物F：5′-TTGTYGAGTTYGGTTTTGG-3′，R：5′-CCTCAATT TCCCACRATTAAAA-3′）；步驟二：連接，配制體積為5 μl的反應液（PCR產物2 μl＋pMD18-T Vector 0.5 μl＋SolutionⅠ2.5 μl），將配制的溶液混勻，放置16℃中連接30 min以上；步驟三：轉化，取出1管凍存的DH5α（200 μl／管）感受態細胞，冰塊中溶解；取5 μl連接產物加入菌液中，輕柔搖勻，冰水浴30 min，42℃熱激90 s，再冰浴2 min；加至500 μl無抗性LB培養基并在搖床中37℃200 r／min培養45 min；超凈臺中取200 μl預轉化的菌液涂抹至含100 μg／ml氨芐的平板上；將平板放于37℃恒溫培養箱中倒置培養過夜，直至克隆完成；步驟四：從平板上挑取多個克隆產物測序（測序工作由上海英駿生物技術公司完成）。依照測序結果，可以判斷目的產物中是否發生甲基化現象。若未發生甲基化現象，基因序列中胞嘧啶經亞硫酸氫鹽修飾等實驗處理后會變成胸腺嘧啶；若發生甲基化現象，基因序列中胞嘧啶則保持不變。

1.3 統計學處理應用SPSS 13.0軟件分析，數據采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 癌組織及相應血標本的甲基化實驗組中癌組織及血漿標本檢測p16基因甲基化的概率分別為43.8%（21／48）、37.5%（18／48），對照組均未檢測出p16基因的甲基化。見圖1、2。

2.2 p16基因甲基化與臨床參數相關性腦膠質瘤患者癌組織及對應血漿標本中p16基因甲基化的發生率與患者的性別、年齡、腫瘤類型、病理分級之間相關性的統計學分析表明p16基因甲基化現象與臨床資料相關性差異無統計學意義。見表1。

3 討論

表1 p16基因甲基化與臨床病理特征關系（n）

隨著腫瘤表觀遺傳學的研究進展，抑癌基因的甲基化是腫瘤發生發展中一個重要的分子事件。王喆等［2］發現膠質瘤中發生p16甲基化率為42.5%（17／40），表明p16基因甲基化的發生率隨腦膠質瘤惡性程度增加而升高；本實驗中腦膠質瘤組織的p16基因甲基化率為43.8%（21／48），與研究［2］結果一致。由此推斷p16基因可能是腦膠質瘤發生發展中一個重要事件，但本實驗并未表明p16基因甲基化與病理分級間差異有統計學意義。本實驗中存在病理診斷為Ⅱ～Ⅲ級的標本，按高級別處理，可能是影響實驗結果的一個原因。擬下一步擴大樣本繼續研究，并以跨高、低級別的腫瘤作為實驗對象。

國外學者［3－4］發現血漿／血清中有大量游離的DNA存在，而腫瘤患者中更甚，結果證實了血液檢測可能成為診斷腫瘤的有力輔助。另外，血標本具有采集方便、微創、價格便宜、適合大片人群普篩等優點，因此，研究血液標本的DNA甲基化是有意義的。研究［5］顯示膠質瘤患者的血清中發生p16基因甲基化率為75%（9／12），并推斷血清檢測有成為膠質瘤分子檢測的潛能。本實驗表明血漿標本中p16甲基化率為37.5%（18／48），對照組中并未發現p16基因的甲基化，兩者差異有統計學意義。由此可以推斷出以血漿標本為檢測物也同樣發現腦膠質與p16基因甲基化存在一定的聯系，為腦膠質瘤的無創性檢查診斷開拓了新思路。

研究［6］表明血漿與癌組織標本中p16基因甲基化檢測結果差異無統計學意義，兩標本檢測的結果的確具有關聯。張振興等［7］也得出類似的結論。本研究顯示血漿標本與癌組織的p16基因甲基化率差異無統計學意義，由此推斷腦膠質瘤中p16基因甲基化檢測，血漿標本與癌組織有著密切的聯系，兩者呈平行相關，但兩者并非一一對應的關系。分析原因一：可能與血漿中DNA檢測甲基化的靈敏度較低于癌組織或是血漿中腫瘤DNA含量少有關。圖1電泳圖顯示癌組織的電泳條帶比血漿標本中的條帶亮可以反映這點。本實驗采用的兩種方法檢測DNA甲基化，提高實驗結果準確性，但無法排出血漿中其他非腫瘤DNA的干擾。原因二：具體腫瘤類型可能存在差異性，具有的不同的分子生物學特征也可能導致這樣實驗結果，可擴大樣本，針對具體腫瘤類型進一步深入研究。

綜上所述，腦膠質瘤患者血漿中檢測p16基因甲基化與癌組織具有平行相關性，血漿檢測具有成為膠質瘤早期診斷指標之一的潛力，但血漿檢測仍有靈敏度較低、部分結果與癌組織檢測不一致等缺陷。

［1］ Holdt L M，Teupser D.Recent studies of the human chromosome 9p21 locus，which is associated with atherosclerosis in human populations［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32（2）：196－206.

［2］ 王 喆，曹培成，張振興，等.p16基因CpG島甲基化與膠質瘤生物學特性的系［J］.中華神經外科疾病研究雜志，2007，6（4）：311－4.

［3］ Leon S A，Shapiro B，Sklaroff D M，et al.Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy［J］.Cancer Res，1977，37（3）：646－50.

［4］ Stroun M，Anker P，Maurice P，et al.Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients［J］.Oncology，1989，46（5）：318－22.

［5］ Wakabayashi T，Natsume A，Hatano H，et al.p16 promoter methylation in the serum as a basis for the molecular diagnosis of gliomas［J］.Neurosurgery，2009，64（3）：455－61.

［6］ 朱沛傳，陳江瑛，張素平.p16基因啟動子在腦膠質瘤患者中的異常甲基化及意義［J］.現代醫院，2011，11（9）：9－12.

［7］ 張振興，管立學，王成東，等.瘤組織和血漿中p16基因CpG島甲基化與腦腫瘤生物學行為的關系［J］.濰坊醫學院學報，2006，28（3）：184－7.

p16 methylation in plasma and tumor tissue of patients with human brain glioma

Deng Pengcheng1，Xu Peikun1，Zhu Lixin2，et al（1Dept of Neurosurgery，2Central Lab，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

The plasma and cancer tissue of the 48 patients for glioma were selected as the experimental group.The necrotic brain tissue and plasma of the 10 patients with traumatic brain injuries were selected as the control group，and the plasma of the 10 healthy people was also selected as the control group.The p16 gene methylation was examinated in samples by methylation specific polymerase chain reaction（MSP）method and bisulfite sequencing after processing（BSP）method.The result shows that the rate of p16 gene methylation in tumor tissues was 43.8%（21／48）and in gliomas，plasma was 37.5%（18／48）.The methylation phenomenon was not found in the control group.The study found that the p16 gene methylation was no significant correlation with clinical data.

glioma；methylation；p16；plasma；tumor tissue

R 739.41

1000－1492（2015）02－0253－03

2014－09－28接收

安徽省科技攻關項目（編號：1301042208）

安徽醫科大學第一附屬醫院1神經外科、2中心實驗室，合肥 230022

鄧鵬程，男，碩士研究生；徐培坤，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：xpkayfy＠163.com