IL－17，IL－6，IL－1β與兒童原發性腎小球疾病的相關性研究

賀麗蓉 邵曉珊 李宇紅 蔣新輝 徐海霞 應蓓 邱杰 鄭莎莎 林俊

（1.貴陽醫學院，貴州 貴陽550004；2.貴陽市兒童醫院腎臟免疫科，貴州 貴陽550003）

原發性腎小球疾病（primary glomerular diseases）在我國腎臟疾病譜中占有重要的地位，是一組原因不明的免疫炎癥反應性疾病，有相似的臨床表現如蛋白尿、血尿、高血壓、不同程度的水腫以及腎功能損害，也是兒童時期最常見的慢性腎臟疾病之一，其確切病因和發病機制尚未完全闡明。近年研究發現，Th17細胞（T help 17cells）在自身免疫性疾病發病過程中起著重要作用［1］。白細胞介素－17（interleukin－17，IL－17）、IL－6和IL－1β是與 Th17細胞密切相關的三種細胞因子，多發性硬化、系統性紅斑狼瘡等患者血漿或病變組織中IL－17或IL－6、IL－1β表達增高，推測其可能參與了這些疾病的發病過程［2－3］。原發性腎小球疾病是常見的自身免疫性疾病。本研究旨在通過檢測IL－17、IL－6和IL－1β的表達，探討它們在原發性腎小球疾病中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集貴陽市兒童醫院腎臟科2013年12月至2014年12月住院的30例確診為原發性腎小球疾病患兒臨床資料。男20例，女10例；發病年齡1.58～14歲，平均（8.2±3.8）歲。其中腎炎型腎病綜合征10例，單純型腎病綜合征10例，腎小球腎炎9例，孤立性血尿1例。同時收集10例健康體檢兒童外周血作為正常對照，男8例，女2例，平均（5.9±3.3）歲。本研究經貴陽市兒童醫院倫理委員會批準同意，符合倫理學標準，家屬知情同意。

1.2 診斷與分型標準

所有病例臨床診斷均符合中華醫學會兒科學分會腎臟病學組2000年11月珠海會議制定的診斷標準［4］，均排除紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、乙肝病毒相關性腎炎等繼發性腎臟疾病及其它免疫性疾病，且均無腎臟病家族史。

1.3 方法

1.3.1 熒 光 定 量 PCR（Real－time PCR）檢 測IL－17mRNA的表達 主要試劑為核酸提取試劑盒（CW0582，康為世紀），逆轉錄試劑盒（C28025－032，Invitrogen公司），2×UltraSYBR Mixture（CW0956，康為世紀）。根據核酸提取試劑盒說明書提供的方法提取血液總RNA。提取后用紫外分光光度計測定所提取RNA的濃度和純度，所有用于逆轉錄的樣品要求比值在1.9～2.1之間。再按照逆轉錄試劑盒提供的方法，逆轉錄合成cDNA。制備的cDNA于－20℃保存備用。然后采用SYBR Green I嵌合熒光法，應用美國Applied Biosystems Stepone Plus熒光定量PCR儀進行擴增檢測。根據 NCBI Gene Bank中人的IL－17的mRNA序列，采用計算機輔助設計（primer5.0）相關引物，由上海生工生物工程技術設計合成、純化。引物序列為：IL－17上游：5＇－GAGAAGATACTGGTGTCCGTGG－3＇，下游：5＇－TGAGTTTAGTCCGAAATGAGGC－3＇（產物大小：171bp）；GAPDH 上游：5＇－TGGACCTGACCTGCCGTCTAG－3＇， 下 游：5＇－AGGAGTGGGT－GTCGCTGTTGA－3＇（產物大小：150bp）。擴增結束后應用Stepone Software v2.1分析軟件進行分析，計算目的基因IL－17的相對表達量。

1.3.2 酶聯免疫吸附試驗（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血漿中細胞因子IL－17、IL－1β及IL－6的表達 收集所有受試者清晨空腹肝素或EDTA抗凝血，收集標本后30min內2500rpm離心5min，分離獲得血漿。采用ELISA法檢測血漿中IL－17、IL－1β及IL－6的含量，操作嚴格按照試劑書說明書進行。ELISA試劑盒購自杭州聯科試劑公司。

1.4 統計學處理

采用GraphPad Prism 5統計軟件進行統計分析。計量資料數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，運用t檢驗；P＜0.05示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Real－time PCR檢測外周血中IL－17mRNA 的表達 IL－17及GAPDH的PCR擴增曲線拐點清楚，指數期明顯，擴增曲線整體平行性好，基線平無上揚現象，說明擴增良好：溶解曲線均為單峰，峰型銳利，其他位置無明顯波形，表明擴增產物單一，特異性好。結果顯示實驗組IL－17mRNA表達水平顯著高于對照組（P＜0.05）。見圖1～3及表1。

圖1 IL－17的擴增曲線（a）和溶解曲線（b）（Tm：83.66℃）

圖2 GAPDH 的擴增曲線（a）和溶解曲線（b）（Tm：83.52℃）

表1 各組外周血中IL－17mRNA的表達（±s）

表1 各組外周血中IL－17mRNA的表達（±s）

相對表達對照組組別 n IL－17mRNA 10 1.095±0.212實驗組 30 4.427±2.870 t 3.636 P＜0.05

圖3 各組外周血中IL－17mRNA的表達

2.2 ELISA 檢測血漿IL－17、IL－1β以及IL－6的表達 原發性腎小球疾病患兒血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的含量均明顯高于正常對照組（P＜0.05），差異有統計學意義。見表2及圖4。

表2 各組血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的水平比較 （pg／mL）

圖4 各組血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的水平比較（pg／mL）

3 討 論

Th17細胞是新發現的一個不同于Th1和Th2細胞的Th細胞亞群。研究表明［5］，Th17細胞參與調節和控制免疫應答，在自身免疫性疾病中發揮著重要作用。IL－17、IL－1β、IL－6、IL－23和 RORγt等在Th17細胞發育、增殖及發揮效應方面起重要作用［6］。

IL－17是Th17細胞分泌的主要效應細胞因子，其受體分布于體內多種組織，是一種強大的前炎癥細胞因子，也是炎癥反應的微調因子，通過促進中性粒細胞和單核細胞聚集，誘導細胞釋放前炎癥因子，引起炎癥細胞浸潤和組織損傷，參與腎臟炎癥反應的發生和發展，在宿主抗細菌感染免疫中發揮重要作用［7－10］。它在慢性炎癥疾病及自身免疫性疾病的發病機制中的作用也成為了研究熱點［11－12］。IL－17作為Th17細胞的特異性效應因子，本實驗采用實時熒光定量PCR對原發性腎小球疾病患兒外周血IL－17mRNA水平進行了檢測，發現IL－17mRNA水平高于正常對照組，結果較普通PCR更精確，特異性更高，證實了原發性腎小球疾病患兒外周血中存在IL－17的異常活化，加重了免疫反應的發生。

研究表明，IL－6，IL－23及IL－1β同時存在能刺激初始 CD4＋T 細胞大量分泌IL－17［13］。IL－17又能夠促進多種細胞，如上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞等分泌IL－1、IL－6等炎癥因子，并且能夠與之協同，放大局部炎癥效應［14］。IL－1β是一種重要的促炎癥因子，誘導炎癥細胞浸潤和其他炎癥因子產生，加重炎癥反應。有研究發現，IL－1β可刺激腎小球系膜細胞活化和增殖，在腎臟疾病的發生、發展過程中起著重要的作用［15］。本研究通過酶聯免疫吸附試驗發現患兒血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的表達水平均明顯增強，提示Th17相關致炎因子IL－17、IL－1β以及IL－6參與了原發性腎小球疾病的發病過程。

IL－1β、IL－6作為 Th17細胞的上游刺激因子配合IL－17作為Th17細胞的下游刺激因子。我們的研究結果顯示，外周血中核酸水平增高同時血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的表達水平均明顯增強，說明Th17細胞的相關炎性因子的異常活化，可能參與了原發性腎小球疾病的發病過程，但其與腎臟疾病的嚴重程度是否有關聯還需進一步擴大樣本量同時配合腎組織病理檢查進行分析。既往有研究報道在 原 發 性 腎 病 綜 合 征 （primary nephrotic syndrome，PNS）患兒腎組織中IL－17表達的陽性率微小病變組高于正常對照組，提示IL－17在兒童PNS的發生及大量蛋白尿的形成方面有顯著作用；腎組織上IL－6的表達在微小病變組較正常對照組無明顯差別，但在非微小病變組明顯升高，提示IL－6在兒童PNS的慢性腎臟病進程中可能有重要作用，但與兒童PNS的發病可能關聯性不強［16］。

隨著基礎和臨床研究的不斷深入，越來越多的數據表明Th17細胞相關炎性因子在一些類型的腎臟炎癥性疾病的發病過程中起重要作用，特異性針對Th17細胞相關炎性因子的治療可能是治療腎臟疾病的新靶點［17］。但是Th17在原發性腎小球疾病中的具體發病機制還不清楚，還需要大量深入的研究去進一步闡明Th17細胞及其相關炎性因子對原發性腎小球疾病的作用及機制，從而為治療原發性腎小球疾病開辟新的道路。

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