IL－17，IL－6，IL－1β與兒童原發(fā)性腎小球疾病的相關性研究

賀麗蓉 邵曉珊 李宇紅 蔣新輝 徐海霞 應蓓 邱杰 鄭莎莎 林俊

（1.貴陽醫(yī)學院，貴州 貴陽550004；2.貴陽市兒童醫(yī)院腎臟免疫科，貴州 貴陽550003）

原發(fā)性腎小球疾病（primary glomerular diseases）在我國腎臟疾病譜中占有重要的地位，是一組原因不明的免疫炎癥反應性疾病，有相似的臨床表現如蛋白尿、血尿、高血壓、不同程度的水腫以及腎功能損害，也是兒童時期最常見的慢性腎臟疾病之一，其確切病因和發(fā)病機制尚未完全闡明。近年研究發(fā)現，Th17細胞（T help 17cells）在自身免疫性疾病發(fā)病過程中起著重要作用［1］。白細胞介素－17（interleukin－17，IL－17）、IL－6和IL－1β是與 Th17細胞密切相關的三種細胞因子，多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等患者血漿或病變組織中IL－17或IL－6、IL－1β表達增高，推測其可能參與了這些疾病的發(fā)病過程［2－3］。原發(fā)性腎小球疾病是常見的自身免疫性疾病。本研究旨在通過檢測IL－17、IL－6和IL－1β的表達，探討它們在原發(fā)性腎小球疾病中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集貴陽市兒童醫(yī)院腎臟科2013年12月至2014年12月住院的30例確診為原發(fā)性腎小球疾病患兒臨床資料。男20例，女10例；發(fā)病年齡1.58～14歲，平均（8.2±3.8）歲。其中腎炎型腎病綜合征10例，單純型腎病綜合征10例，腎小球腎炎9例，孤立性血尿1例。同時收集10例健康體檢兒童外周血作為正常對照，男8例，女2例，平均（5.9±3.3）歲。本研究經貴陽市兒童醫(yī)院倫理委員會批準同意，符合倫理學標準，家屬知情同意。

1.2 診斷與分型標準

所有病例臨床診斷均符合中華醫(yī)學會兒科學分會腎臟病學組2000年11月珠海會議制定的診斷標準［4］，均排除紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、乙肝病毒相關性腎炎等繼發(fā)性腎臟疾病及其它免疫性疾病，且均無腎臟病家族史。

1.3 方法

1.3.1 熒 光 定 量 PCR（Real－time PCR）檢 測IL－17mRNA的表達 主要試劑為核酸提取試劑盒（CW0582，康為世紀），逆轉錄試劑盒（C28025－032，Invitrogen公司），2×UltraSYBR Mixture（CW0956，康為世紀）。根據核酸提取試劑盒說明書提供的方法提取血液總RNA。提取后用紫外分光光度計測定所提取RNA的濃度和純度，所有用于逆轉錄的樣品要求比值在1.9～2.1之間。再按照逆轉錄試劑盒提供的方法，逆轉錄合成cDNA。制備的cDNA于－20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ缓蟛捎肧YBR Green I嵌合熒光法，應用美國Applied Biosystems Stepone Plus熒光定量PCR儀進行擴增檢測。根據 NCBI Gene Bank中人的IL－17的mRNA序列，采用計算機輔助設計（primer5.0）相關引物，由上海生工生物工程技術設計合成、純化。引物序列為：IL－17上游：5＇－GAGAAGATACTGGTGTCCGTGG－3＇，下游：5＇－TGAGTTTAGTCCGAAATGAGGC－3＇（產物大小：171bp）；GAPDH 上游：5＇－TGGACCTGACCTGCCGTCTAG－3＇， 下 游：5＇－AGGAGTGGGT－GTCGCTGTTGA－3＇（產物大小：150bp）。擴增結束后應用Stepone Software v2.1分析軟件進行分析，計算目的基因IL－17的相對表達量。

1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血漿中細胞因子IL－17、IL－1β及IL－6的表達 收集所有受試者清晨空腹肝素或EDTA抗凝血，收集標本后30min內2500rpm離心5min，分離獲得血漿。采用ELISA法檢測血漿中IL－17、IL－1β及IL－6的含量，操作嚴格按照試劑書說明書進行。ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科試劑公司。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，運用t檢驗；P＜0.05示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Real－time PCR檢測外周血中IL－17mRNA 的表達 IL－17及GAPDH的PCR擴增曲線拐點清楚，指數期明顯，擴增曲線整體平行性好，基線平無上揚現象，說明擴增良好：溶解曲線均為單峰，峰型銳利，其他位置無明顯波形，表明擴增產物單一，特異性好。結果顯示實驗組IL－17mRNA表達水平顯著高于對照組（P＜0.05）。見圖1～3及表1。

圖1 IL－17的擴增曲線（a）和溶解曲線（b）（Tm：83.66℃）

圖2 GAPDH 的擴增曲線（a）和溶解曲線（b）（Tm：83.52℃）

表1 各組外周血中IL－17mRNA的表達（±s）

表1 各組外周血中IL－17mRNA的表達（±s）

相對表達對照組組別 n IL－17mRNA 10 1.095±0.212實驗組 30 4.427±2.870 t 3.636 P＜0.05

圖3 各組外周血中IL－17mRNA的表達

2.2 ELISA 檢測血漿IL－17、IL－1β以及IL－6的表達 原發(fā)性腎小球疾病患兒血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的含量均明顯高于正常對照組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義。見表2及圖4。

表2 各組血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的水平比較 （pg／mL）

圖4 各組血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的水平比較（pg／mL）

3 討 論

Th17細胞是新發(fā)現的一個不同于Th1和Th2細胞的Th細胞亞群。研究表明［5］，Th17細胞參與調節(jié)和控制免疫應答，在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用。IL－17、IL－1β、IL－6、IL－23和 RORγt等在Th17細胞發(fā)育、增殖及發(fā)揮效應方面起重要作用［6］。

IL－17是Th17細胞分泌的主要效應細胞因子，其受體分布于體內多種組織，是一種強大的前炎癥細胞因子，也是炎癥反應的微調因子，通過促進中性粒細胞和單核細胞聚集，誘導細胞釋放前炎癥因子，引起炎癥細胞浸潤和組織損傷，參與腎臟炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展，在宿主抗細菌感染免疫中發(fā)揮重要作用［7－10］。它在慢性炎癥疾病及自身免疫性疾病的發(fā)病機制中的作用也成為了研究熱點［11－12］。IL－17作為Th17細胞的特異性效應因子，本實驗采用實時熒光定量PCR對原發(fā)性腎小球疾病患兒外周血IL－17mRNA水平進行了檢測，發(fā)現IL－17mRNA水平高于正常對照組，結果較普通PCR更精確，特異性更高，證實了原發(fā)性腎小球疾病患兒外周血中存在IL－17的異常活化，加重了免疫反應的發(fā)生。

研究表明，IL－6，IL－23及IL－1β同時存在能刺激初始 CD4＋T 細胞大量分泌IL－17［13］。IL－17又能夠促進多種細胞，如上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞等分泌IL－1、IL－6等炎癥因子，并且能夠與之協(xié)同，放大局部炎癥效應［14］。IL－1β是一種重要的促炎癥因子，誘導炎癥細胞浸潤和其他炎癥因子產生，加重炎癥反應。有研究發(fā)現，IL－1β可刺激腎小球系膜細胞活化和增殖，在腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用［15］。本研究通過酶聯(lián)免疫吸附試驗發(fā)現患兒血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的表達水平均明顯增強，提示Th17相關致炎因子IL－17、IL－1β以及IL－6參與了原發(fā)性腎小球疾病的發(fā)病過程。

IL－1β、IL－6作為 Th17細胞的上游刺激因子配合IL－17作為Th17細胞的下游刺激因子。我們的研究結果顯示，外周血中核酸水平增高同時血漿中IL－17、IL－1β以及IL－6的表達水平均明顯增強，說明Th17細胞的相關炎性因子的異常活化，可能參與了原發(fā)性腎小球疾病的發(fā)病過程，但其與腎臟疾病的嚴重程度是否有關聯(lián)還需進一步擴大樣本量同時配合腎組織病理檢查進行分析。既往有研究報道在 原 發(fā) 性 腎 病 綜 合 征 （primary nephrotic syndrome，PNS）患兒腎組織中IL－17表達的陽性率微小病變組高于正常對照組，提示IL－17在兒童PNS的發(fā)生及大量蛋白尿的形成方面有顯著作用；腎組織上IL－6的表達在微小病變組較正常對照組無明顯差別，但在非微小病變組明顯升高，提示IL－6在兒童PNS的慢性腎臟病進程中可能有重要作用，但與兒童PNS的發(fā)病可能關聯(lián)性不強［16］。

隨著基礎和臨床研究的不斷深入，越來越多的數據表明Th17細胞相關炎性因子在一些類型的腎臟炎癥性疾病的發(fā)病過程中起重要作用，特異性針對Th17細胞相關炎性因子的治療可能是治療腎臟疾病的新靶點［17］。但是Th17在原發(fā)性腎小球疾病中的具體發(fā)病機制還不清楚，還需要大量深入的研究去進一步闡明Th17細胞及其相關炎性因子對原發(fā)性腎小球疾病的作用及機制，從而為治療原發(fā)性腎小球疾病開辟新的道路。

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