乳腺癌中VEGF－D的表達與微血管密度、微淋巴管密度的關系

段筱娟 李志義△ 楊玉濤 鐘美 饒家秋 何常

（1.貴陽市第一人民醫院病理科，貴州 貴陽550002；2.貴陽中醫學院第二附屬醫院，貴州 貴陽550002；3.貴陽醫學院附屬醫院病理科，貴州 貴陽550001）

乳腺癌的診治取得了重大的進步，但轉移復發是造成乳腺癌患者死亡的主要原因。在浸潤轉移過程中，微脈管系統的作用不容忽視，經血道轉移和淋巴道轉移是惡性腫瘤細胞轉移的重要途徑。血管內皮生長因子D（VEGF－D）是VEGFs成員之一，它可與位于血管內皮細胞上的VEGFR－2結合調節血管生成，與位于淋巴管內皮細胞上的VEGFR－3結合調節淋巴管生成，從而促進腫瘤的轉移。本實驗通過免疫組化法檢測VEGF－D和 MVD（由CD105標記）、MLD（由D2－40標記），探討乳腺癌組織中VEGF－D的表達及其與MVD、MLD、臨床病理參數之間的關系。

1 材料與方法

1.1 病例收集 收集2009年1月至2013年12月貴陽市第一人民醫院和貴陽中醫學院第二附屬醫院病理科存檔病例，乳腺癌50例，收集同期乳腺增生癥10例作對照。

1.2 免疫組織化學法染色 采用EnVision二步法分別行VEGF－D和CD105、D2－40染色。石蠟切片常規脫蠟至水；3%H2O2去離子水室溫孵育10min；蒸餾水漂洗，置于PBS中震蕩10min；高壓鍋熱修復；PBS沖洗，滴加一抗，37℃水浴孵育1h；PBS沖洗，滴加二抗，濕盒37℃水浴孵育30min；PBS沖洗，應用DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察，適時終止；復染、脫水、透明、封片。用PBS緩沖液替代一抗作空白對照，用已知陽性片作陽性對照。VEGF－D抗體購自武漢博士德生物技術有限公司，CD105和D2－40抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，通用型二抗購自廣州深達公司。

1.3 結果判斷 以乳腺腺上皮細胞或癌細胞胞漿內出現黃色顆粒為VEGF－D陽性（圖1），采用半定量積分法［1］判斷結果，每張染色切片隨機選取5個染色均勻的高倍視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞百分率，＜5%賦值為0，5%～25%為1，26%～75%為2，≥76%為3。染色程度標準據每張切片的大多數細胞染色特征決定，沒有染色賦值為0，淺黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3。最終結果由陽性細胞百分率與染色強度的乘積決定：0～2分為（－），3～4分為（＋），5～7分為（＋＋），8～9分為（＋＋＋）。CD105陽性表達于血管（圖2），D2－40陽性表達于淋巴管（圖3），MVD、MLD計數：首先在低倍鏡（×100）下找出脈管比較密集的區域，即“熱點”區，然后在高倍鏡（×400）計數每個區域的脈管數量，取平均值作為MVD、MLD。每張切片選取5個“熱點”。

圖2 CD105陽性表達于乳腺癌 血管（EnVision法高倍放大）

圖3 D2－40陽性表達于乳腺癌淋巴管 （EnVision法低倍放大）

1.4 統計學處理 運用SPSS 16.0統計軟件數據包進行數據處理，計量資料比較用t檢驗，計數資料比較用χ2檢驗，相關性采用Pearman相關分析，MVD、MLD用ˉx±s表示，按檢驗水準P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 臨床資料 50例乳腺癌病例的臨床病理特征為：年齡34～84歲，中位年齡49歲，＜50歲25例，≥50歲25例；腫瘤≤2cm 18例，＞2cm 32例；組織學類型均為浸潤性導管癌，按照WHO乳腺癌病理分級分：Ⅰ級4例，Ⅱ級31例，Ⅲ級15例；淋巴結轉移20例，無淋巴結轉移30例。

2.2 乳腺癌和乳腺增生癥組織中VEGF－D的表達及 MVD、MLD VEGF－D的陽性表達率（64.00%）及 MVD（16.96±8）、MLD（2.37±0.91）在乳腺癌組明顯高于乳腺增生癥組（10.00%，1.46±0.67，0.86±0.67），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 VEGF－D、MVD、MLD與乳腺癌臨床病理參數之間的關系 VEGF－D、MVD、MLD與乳腺癌組織學分級有相關性，MVD和MLD與淋巴結轉移密切相關（P＜0.05）。見表1。

表1 VEGF－D、MVD、MLD與乳腺癌臨床病理參數之間的關系

2.4 乳腺癌組織中 VEGF－D的表達與 MVD、MLD之間的關系 乳腺癌組織中VEGF－D表達為（－）、（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）者 MVD分別為（8.83±3.29）、（17.62±4.31）、（20.75±5.24）、（29.00±6.29），MLD分別為（1.79±0.87）、（2.38±0.55）、（3.00±0.86）、（4.21±0.60），相關性分析顯示VEGF－D與 MVD、MLD均呈正相關（P＜0.05）。

3 討 論

乳腺癌淋巴管生成及其轉移成為研究熱點。Stacker［2］等發現VEGF－D可以加快腫瘤生長和血管生成，而且用抗VEGF－D的抗體可以遏制腫瘤轉移。Gu Y［3］等對61例乳腺癌手術標本的研究發現，VEGF－D在乳腺癌中的表達明顯高于乳腺良性病變，癌細胞VEGF－D高表達伴有高的淋巴管密度，此類患者的預后也差，提示VEGF－D在乳腺癌的淋巴管形成中發揮了重要的作用，使癌細胞更具侵襲性，導致不良的預后。本實驗中，VEGF－D的表達及MVD、MLD在乳腺增生癥組中明顯低于乳腺癌組，VEGF－D陽性組的 MVD、MVD高于陰性組的，且VEGF－D的表達水平與 MVD、MLD均呈正相關，進一步證實VEGF－D在脈管的發育上具有雙重作用，即可以刺激血管內皮增殖，又可以促進淋巴管生成。本實驗結果顯示乳腺癌低分化組的MVD、MLD高于中、高分化組，有淋巴結轉移組的MVD、MLD高于無淋巴結轉移組，差異均有統計學意義，說明乳腺癌組織內的MVD、MLD與腫瘤細胞的分化程度、侵襲能力和淋巴轉移均有一定的關系，腫瘤MVD、MLD較高者，有較強的侵襲能力和轉移能力。但是VEGF－D陽性率在有淋巴結轉移組明顯低于無淋巴結轉移組，分析原因可能是：（1）VEGF－D在不同腫瘤內酶解加工的程度不同；（2）VEGF－D雖然在腫瘤中可刺激淋巴管生成，但在淋巴系統的發展過程中VEGF－D不起重要作用或者是在發展過程中同時存在其他淋巴管生長因子的調控機制，補償了 VEGF－D的作用［4］。故 VEGF－D參與了乳腺癌血管和淋巴管生成。MVD和MLD與腫瘤的分化程度、侵襲能力和轉移密切相關，可作為預測預后和轉移的指標。

［1］ 邢傳平，劉斌，董亮.免疫組織化學標記結果的判斷方法［J］.中華病理學雜志，2001，30（4）：318.

［2］ Stacker SA，Caesar C，Baldwin ME，et al.VEGF－D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics［J］.Nat Med，2001，7（2）：186－191.

［3］ Gu Y，Qi X，Guo S，et al.Lymphangiogenesis induced by VEGF－C and VEGF－D promotes metastasis and a poor outcome in breast carcinoma retrospective study of 61cases［J］.Clin Exp Metastasis，2008，25（7）：717－725.

［4］ Baldwin M E，Halford M M，Roufail S，et al.Vascular endothelial growth factor D is dispensable for development of the lymphatic sydtem［J］.Mol Cell Biol，2005，25（6）：2441－49.