正交試驗優(yōu)選扶正生血膠囊提取工藝

鞠 楷，張 明，于波濤，范開華，金偉華，譚永紅，陳 華

扶正生血膠囊是依據(jù)我院老中醫(yī)經(jīng)驗方研發(fā)的中藥新藥，由補骨脂、鹿茸、虎杖等中藥材組成，具有滋陰培陽，益腎健脾，扶正固本，補氣益血的功效，可用于腫瘤放化療后的支持治療，亦可用于再生障礙性貧血、失血性貧血及其他不明原因引起的全血細(xì)胞減少等癥。 其原劑型為煎劑，為方便患者使用，我院將其研究開發(fā)制成膠囊劑。 在保證制劑質(zhì)量的基礎(chǔ)上，本實驗根據(jù)處方中藥物的化學(xué)成分及理化性質(zhì)，結(jié)合處方的功能主治，采用正交試驗設(shè)計優(yōu)選該制劑的提取工藝[1-3]，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀 （四元泵、G1314B VWD 檢 測 器、Agilent Eclipse XDB-C18分析柱， 美國安捷倫公司）；AL204 電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；101-2B 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海市實驗儀器總廠)。

1.2 試劑 白藜蘆醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：121028-200909)。 中藥飲片均購于成都市益誠藥業(yè)有限公司，經(jīng)本院中藥房主任藥師曹均告鑒定符合《中國藥典》2010 年版一部相關(guān)項下規(guī)定。水為三重蒸餾水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 干膏得率的測定 按處方比例稱取扶正生血膠囊中的藥材一定量，加入適量的水，于一定時間煎煮一定次數(shù)，濾過，濃縮，蒸干，稱定干膏重量，干膏得率=干膏重量/每份藥材質(zhì)量×100%[4]。

2.2 白藜蘆醇的含量測定

2.2.1 色譜 條件 色 譜 柱：Eclipse XDB-C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相：乙腈-水（23：77）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；紫外檢測波長：306nm；進樣量：20μl。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取白藜蘆醇對照品7.2 mg，置于100 ml 棕色量瓶中，加50%乙醇溶解并稀釋至刻度，即得濃度為72 μg/ml 的白藜蘆醇對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取2.1 項下研細(xì)的干膏粉末0.3 g，精密加入50%乙醇30 ml，稱重，超聲30 min，放冷稱重，用50%乙醇補足減失重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例制成缺虎杖的陰性樣品， 按2.2.3 項下方法制得陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗 精密吸取對照品溶液、 供試品溶液及陰性對照溶液各20 μl， 按上述色譜條件進樣測定。 結(jié)果顯示，陰性對照溶液在與白藜蘆醇對照品相應(yīng)出峰處未見吸收峰，表明陰性對照溶液無干擾，見圖1。

圖1 扶正生血膠囊色譜圖

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 分別精密量取白藜蘆醇對照品溶液1、2、3、4、5、10 ml，置于10 ml 量瓶中，加50%乙醇定容， 制成濃度分別為7.2、14.4、21.6、28.8、36.0、72.0 μg/ml 的對照品溶液。 分別精密吸取20 μl 注入色譜儀， 按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積。 以對照品濃度X 為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y 為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程為Y=6146X+160.15（r= 0.9992）。 結(jié)果表明，白藜蘆醇在7.2 ～72.0 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取2.2.2 項下對照品溶液20 μl，連續(xù)進樣6 次，按上述色譜條件進樣測定。結(jié)果，RSD 為2.18%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取同一批樣品， 精密稱取6份，分別按2.2.3 項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定。 結(jié)果，RSD=2.33%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取同一批樣品的供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10 h 進樣，按上述色譜條件測定，記錄峰面積。結(jié)果，RSD=2.60%（n=6），表明供試品溶液在10 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3 正交試驗優(yōu)選 在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，按處方稱取藥材9 份(每組試驗平行操作3 次)， 每份重983 g，采用L9(34)正交試驗法對水煎煮提取工藝進行優(yōu)選。 以白藜蘆醇含量和干膏得率為指標(biāo)，考察加水倍數(shù)(A)、煎煮時間(B)、煎煮次數(shù)(C)對提取工藝的影響。 因素水平見表1。

表1 提取工藝正交設(shè)計表因素水平

2.4 水煎煮工藝正交試驗 正交試驗安排及結(jié)果見表2。 應(yīng)用SPSS16. 0 進行方差分析，方差分析結(jié)果見表3、4。

根據(jù)實驗結(jié)果可知，以白藜蘆醇含量為評價指標(biāo)時， 各因素對提取工藝的影響程度依次為C＞A＞B，每個因素的水平主次為C3＞C2＞C1、A1＞A2＞A3、B1＞B2＞B3。 由此可見，最佳提取工藝為A1B1C3，即加10倍量水，煎煮3 次，每次120 min；以干膏得率為評價指標(biāo)時， 各因素對提取工藝的影響程度依次為C＞A＞B， 每個因素的水平主次為C3＞C2＞C1、A1＞A2＞A3。 方差分析因素A、C 有顯著影響，因素B 影響不顯著。 由此可見，最佳提取工藝為A1B3C3，即加10倍量水煎煮3 次，每次60 min。 由于白藜蘆醇的抗菌、抗炎、抗過敏、抗血栓、抗氧化、抗自由基以及抗癌、抗誘變[5-7]等作用在本處方功效中有很重要的影響，所以，本實驗提取工藝最優(yōu)選擇以白藜蘆醇的含量為主要導(dǎo)向，即以工藝A1B1C3為最佳。 不過從表2、3 可以看出，B 因素各水平間差異較小，所以，從節(jié)能、 節(jié)時的角度考慮， 確定最佳提取工藝為A1B2C3，即加10 倍量水煎煮3 次，每次90 min。

表2 水煎煮工藝正交試驗安排及結(jié)果

表3 白藜蘆醇含量正交試驗結(jié)果方差分析

表4 干膏得率正交試驗結(jié)果方差分析

2.5 工藝驗證試驗 按處方稱取藥材共3 份，按最佳提取工藝A1B2C3提取，分別測定干膏中白藜蘆醇含量及干膏得率，3 次平行試驗結(jié)果分別為：白藜蘆醇含量：0.4909 mg/g、0.4985 mg/g、0.5169 mg/g；干膏得率：30.32%、29.80%、31.61%。 白藜蘆醇含量和干膏得率的RSD 分別為0.89%，1.02%。 驗證結(jié)果表明，按最佳提取工藝A1B2C3所得的白藜蘆醇含量及干膏得率都超過正交試驗中的最大值，可以認(rèn)為該工藝提取較完全，且其白藜蘆醇含量和干膏得率均較穩(wěn)定，說明該工藝可行。

3 討論

在對虎杖的有效成分白藜蘆醇提取溶劑的選擇上，筆者先參照藥典中虎杖的提取方法選用稀乙醇提取，但此條件下的白藜蘆醇峰形不好。 后參考王磊等[8]建立的虎杖商品藥材中白藜蘆醇苷的含量測定方法中溶劑的最佳濃度，最終確定用50%乙醇作為溶劑，測得的白藜蘆醇峰形好，分離度好。

筆者采用正交試驗，擬定加水倍數(shù)、煎煮時間、煎煮次數(shù)3 個因素對提取工藝進行優(yōu)選， 結(jié)果表明：無論以白藜蘆醇含量，還是干膏得率為評價指標(biāo)， 煎煮次數(shù)都是影響最大的， 故最終選擇煎煮3次有利于有效成分盡可能溶出。 其次，加水倍數(shù)也有較大影響，呈現(xiàn)出有效成分溶出隨加水倍數(shù)增大而增加的趨勢，故最終選擇加10 倍量水。最后，在3個因素中，煎煮時間影響最小，但90 min 和120 min相比于60 min 有效成分溶出還是有所增長， 故最終以節(jié)能、節(jié)時為考慮選擇煎煮時間為90 min。

本實驗通過正交試驗和工藝驗證實驗優(yōu)選了最佳提取工藝，在該工藝條件下，白藜蘆醇含量和干膏得率均較穩(wěn)定， 且都超過正交試驗中的最大值，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了專業(yè)的理論依據(jù)。

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