運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)對75例急性白血病免疫分型的表型分析

張 航 楊 梅

（貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗科，貴州 貴陽550001）

隨著流式細(xì)胞術(shù)（FCM）對AL免疫分型檢測的應(yīng)用，大大提高了AL分型的準(zhǔn)確性，AL形態(tài)分型與臨床的符合率僅有70%左右，結(jié)合免疫分型后AL分型準(zhǔn)確率可達(dá)到90%以上。現(xiàn)就應(yīng)用FCM對我院75例初診AL患者進(jìn)行免疫表型分型的資料分析如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 隨機(jī)選擇75例經(jīng)FAB分型初診為AL的我院2011年3月至2014年6月住院患者，男性39例，女性36例；年齡13～77歲。按FAB分型標(biāo)準(zhǔn)［1］分為：急性髓系白血病（AML）45例，其中M02例，M19例，M220例，M34例，M45例，M54例，M61例；急性淋巴細(xì)胞白血病（ALL）25例，其中L17例，L213例，L35例；另有5例未能明確分型。

1.2 儀器與試劑 流式細(xì)胞分析儀為美國Beckmen Coulter公司生產(chǎn)，型號Epics－XL；試劑為美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的單克隆抗體，髓系標(biāo)志抗體有：MPO、CD13、CD14、CD33、CD41、CD117、GlyA；T淋巴標(biāo)志抗體有：cCD3、CD2、CD5、CD7；B淋巴標(biāo)志抗體有：cCD79a、CD10、CD19、CD20；NK細(xì)胞抗體有：CD（16＋56）；非系列抗體有：CD45、CD34、HLA－DR；同型對照抗體：IgG1、IgG2a；白細(xì)胞破膜劑、紅細(xì)胞溶血劑均購自貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法 胞膜抗原檢測，采用三色熒光抗體直接標(biāo)記肝素抗凝的骨髓懸液（細(xì)胞數(shù)＞1×106／mL），每管加熒光抗體20μL，加骨髓懸液100μL，混勻置室溫避光反應(yīng)30min，同時做同型對照；加溶血劑3mL溶血30min后，用PBS洗滌1次，加0.5mL PBS重懸待測；胞質(zhì)抗原檢測：采用四色熒光抗體標(biāo)記經(jīng)破膜處理過的骨髓白細(xì)胞，每管加熒光抗體20μL，經(jīng)破膜的骨髓白細(xì)胞懸液（細(xì)胞數(shù)＞1×106／mL）100μL，混勻置室溫避光反應(yīng)30min，同時做同型對照，用PBS洗滌1次，加0.5mL PBS重懸待測。FCM檢測分型，流式細(xì)胞儀檢測，每次計數(shù)10 000個細(xì)胞以上，通過側(cè)向散射光信號（SSC）與CD45雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門，框選出異常細(xì)胞群（原幼細(xì)胞群），分析門內(nèi)細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)白血病抗原的表達(dá)情況；細(xì)胞膜抗原表達(dá)率≥20%，細(xì)胞質(zhì)抗原表達(dá)率≥10%，判定為陽性表達(dá)；免疫分型依據(jù)國際白血病歐洲協(xié)作組（EGIL）的積分標(biāo)準(zhǔn)［2］。

2 結(jié) 果

45例AML，單純型AML31例，Ly＋AML14例，各 抗 原 陽 性 率 依 次 是 CD13（95.56%）、CD33（86.67%）、MPO（82.22%）、CD117（71.11%）、HLADR（62.22%）、CD7（26.67%）、CD14（20.00%）、CD5（13.33%）、CD19（4.44%）。10例 T－ALL，單純 TALL8例，My＋T－ALL2例，各抗原陽性率依次是CD2（100%）、cCD3（100%）、CD7（90.00%）、CD5（70.00%）、CD13（28.57%）。14例 B－ALL，單純 BALL11例，My＋B－ALL 3例，各抗原陽性率依次是CD19（100%）、CD79a （92.86%）、CD10（71.42%）、CD20（57.14%）、CD13（14.29%）、CD33（7.14%）。FAB不能明確分型的5例AL，4例為MAL，其中2例 AML／T－ALL，主要表達(dá)抗原有CD13、CD33、CD2、CD7、MPO、cCD3、HLA－DR、CD34；1 例 JJAML／BALL，主要表達(dá)抗原有 CD13、CD14、CD10、CD19、MPO、cCD79a、CD34；1例AML／T－ALL／B－ALL，主要表達(dá) 抗 原 CCD13、CD33、CD7、CD10、MPO、cCD3、cCD79a、HLA－DR、CD34。另1例表達(dá)CD2、CD7、CD（16＋56），符合NK細(xì)胞白血病表型。1例FAB形態(tài)初診ALL－L2的患者，最后通過免疫分型確診為AUL，表達(dá)抗原有CD34、HLA－DR、CD7。見表1。

表1 75例AL免疫表型

3 討 論

CD45是所有白細(xì)胞的共同抗原，但不同白細(xì)胞和不同分化階段CD45的表達(dá)強(qiáng)度不同，SSC反映細(xì)胞顆粒性和成熟度，所以利用SSC／CD45雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門，能有效地把白血病細(xì)胞群（原始／幼稚細(xì)胞）和正常細(xì)胞群區(qū)分開來［3］。FCM進(jìn)行白血病免疫分型獲得白血病細(xì)胞的抗原表達(dá)信息，用系列積分法將其分為單純型AML、單純型ALL、變異型（Ly＋AML和 My＋ALL）、MAL、AUL。本資料45例AML中，陽性率靠前的抗原分別是 CD13（95.56%）、CD33（86.67%）、MPO（82.22%）、CD117（71.11%），可見 CD13、CD33、MPO對髓系白血病的診斷具有重要意義，尤其是胞質(zhì)MPO對診斷AML有決定性作用。有研究顯示CD117極少表達(dá)于ALL，所以CD117被作為鑒別AML和ALL的重要抗原［4］；CD34是干／祖細(xì)胞相關(guān)抗原，隨著造血細(xì)胞的分化成熟而逐漸消失，CD34、HLA－DR多表達(dá)于低分化類型M0、M1、M4、M5，分化較成熟的 M3極少表達(dá)，本研究中的4例M3高表達(dá)CD13和CD33，不表達(dá)CD34、HLA－DR，與文獻(xiàn)報道一致［5］。研究中1例患者在SSC／CD45散點(diǎn)圖中出現(xiàn)兩群異常細(xì)胞，其中一群細(xì)胞C45＋主要表達(dá)CD13、CD33、CD117、CD34、HLA－DR，而另一群CD45－僅有GlyA表達(dá)，結(jié)合形態(tài)符合M6；變異型（Ly＋AML）14例，以CD7表達(dá)常見，其次是CD5、CD19。

現(xiàn)有的FAB分別標(biāo)準(zhǔn)很難區(qū)分T－ALL和BALL，而FCM免疫分型就可以根據(jù)白血病細(xì)胞抗原的表達(dá)信息將其明確分開。本研究中10例TALL，主要表達(dá)抗原是CD2、cCD3、CD7、CD5，以上抗原診斷T－ALL具有很高價值，尤其是胞質(zhì)抗原cCD3最為特異。14例B－ALL主要表達(dá)抗原是CD19、cCD79a、CD10、CD20，這些抗原對診斷 BALL具有很高價值，以胞質(zhì)抗原cCD79a最為特異。My＋ALL 5例，以CD13表達(dá)常見、其次是CD33。因此FCM免疫分型對ALL判斷細(xì)胞來源，區(qū)分TALL和B－ALL及亞型都具有重要意義。

本研究中FAB不能明確分型的5例AL患者，通過FCM免疫分型表達(dá)抗原積分法顯示，明確4例為MAL，其中2例同時表達(dá)髓系和T淋巴系抗原，1例同時表達(dá)髓系和B淋巴系抗原，1例同時表達(dá)髓系和T、B淋巴系抗原，系屬抗原積分均＞2分。胞質(zhì)抗原MPO、cCD3、cCD79a積分均為2分，可見MPO、cCD3、cCD79a對鑒別混合白血病具有重要意義。混合白血病診斷中對于僅表達(dá)個別或次要相關(guān)抗原，系屬積分＜2分，不能診斷為雙系或雙表型白血病，應(yīng)歸為Ly＋AML或My＋ALL。由于白血病細(xì)胞起源和分化的異質(zhì)性，MAL可能表型為雙系列或雙表型、雙克隆甚至多種類型組成的混合型，在實際工作中要明確分類較為困難，需要進(jìn)一步研究。NK細(xì)胞白血病特異表型為CD3－／CD（16＋56）＋，本研究中1例FAB不能明確分型的患者通過FCM免疫分型符合NK細(xì)胞白血病表型。AUL特點(diǎn)是無系屬抗原表達(dá)，但常有非系屬抗原CD34、HLA－DR及CD7表達(dá)［6］，本研究中1例患者FAB初診為ALL－L2，經(jīng)FCM免疫分型的結(jié)果顯示是CD34＋／HLA－DR＋／CD7＋，其它系屬抗原均為陰性，最終確診為AUL。

應(yīng)用FCM對白血病免疫分型，具有特異、準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好的特點(diǎn)，彌補(bǔ)了FAB形態(tài)分型的不足，提高了AL診斷的準(zhǔn)確性，尤其是對復(fù)雜類型白血病的診斷具有重要價值。

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