基于線粒體ATP6基因序列的作物系統發育研究

胡曉天，向 妍，張 柯，劉齊元，范彥君，周 瑋

（1. 湖南農業大學植物保護學院，植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128； 2. 湖南農業大學，湖南省生物農藥與制劑加工工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 江西農業大學農學院，作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室，江西 南昌 330045）

基于線粒體ATP6基因序列的作物系統發育研究

胡曉天1,2，向 妍1,2，張 柯1,2，劉齊元3，范彥君1,2，周 瑋1,2

（1. 湖南農業大學植物保護學院，植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128； 2. 湖南農業大學，湖南省生物農藥與制劑加工工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 江西農業大學農學院，作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室，江西 南昌 330045）

ATP6編碼ATP合酶a亞基，對酶正常功能的實現作用重要。為探討線粒體ATP6基因在作物系統發育分析上的應用，采用NJ法的Kimura 2-parameter模型、E距離模型，以及最大似然法對30種作物進行分子系統樹構建，并結合植物形態學分類結果進行比較分析。結果表明，基于NJ法和最大似然法的ATP6系統發育樹聚類結果一致，契合現有植物形態學分類，在分析作物物種分化起源上有巨大潛力。

ATP合酶；ATP6基因；作物；系統發育

線粒體ATP合酶也叫F1Fo-ATP合酶或復合體Ⅴ，是一個位于線粒體內膜的旋轉酶，與呼吸鏈復合體Ⅰ-Ⅳ在一起[1]。線粒體ATP合酶由兩個功能結構域組成：F1處于線粒體的基質中，Fo結合在線粒體內膜上[2]。F1是是水溶性的，突出于線粒體內膜內側，由3個α和β亞基，以及1個γ、δ和ε亞基構成[2-3]。Fo包含一個c環亞基，a、b、d、F6亞基和一個寡霉素敏感相關蛋白（the oligomycinsensitivity-conferring protein，OSCP）。隨著質子流經Fo部分的a亞基進入c環亞基，質子濃度梯度驅動兩個分子發動機轉動：c環亞基繞著與之相連的中央柱狀結構轉動，其又帶動被α3β3六聚體包著一端的γ亞基轉動，為ATP合成提供能量[2]。在整個催化過程中，由于外圍柱狀結構的作用，α3β3六聚體相對于a亞基總是保持固定。因此ATP合酶可以被機械地劃分為“轉動子”（c環、γ、δ、ε亞基）和“固定子”（α3β3、a、b、d、F6、OSCP亞基）[2]。

ATP合酶并不是以“孤島”形式結合在線粒體內膜上的，而是有規律地以二聚體或更高形式的寡聚體組織在一起。a亞基由于可能存在大量的跨膜螺旋而被認為對ATP合酶的二聚作用有著重要的影響[4]。兩個Fo部分的亞基：a亞基和A6L亞基分別由線粒體ATP6（mitochondrialDNA encoded ATP6，MT-ATP6）和ATP8（mitochondrial DNA encoded ATP8，MT-ATP8）編碼。在人體中，缺失了線粒體DNA（即a亞基和A6L亞基不能形成），余下的ATP合酶亞基會裝配成一個550 kD的復合體，略小于完整的ATP合酶（597kD）[4]。MT-ATP6和MT-ATP8基因的突變會引起ATP合酶的變異，MT-ATP6突變是最早報導[5]且目前報導最頻繁的ATP合酶基因缺陷；在人體中MTATP6的點突變會導致人的一系列臨床疾病[6]。a亞基尚有另兩個功能：引導質子從線粒體內膜進入線粒體基質中；另一功能致使在膜內接觸a亞基的c環亞基轉動，由此產生的機械能誘導F1外膜結構域催化位點的構象變化，幫助ATP合成[2]。

在基于序列分析的真核生物分類上，由于26SrDNA含有能區分相同和不同物種的保守區和可變區，被廣泛地應用于酵母分類[7]。也有將其應用于植物分類并討論選取序列中的不同區段如保守核心、擴展片段或整個序列等對構樹結果的影響[8]。MT-ATP6所編碼的蛋白質產物在ATP合酶中起著重要的作用[2,4,9-10]，其序列中某些位點的突變可能會引發一系列生物學問題[6,11-12]，但也可能用于物種分類分析。文中擬以不同方法模型對多種作物ATP6序列進行系統發育樹構建，以探討ATP6序列在作物分類上的應用。

1 材料與方法

1.1 實驗數據

從美國國立生物技術信息中心（NCBI）同時下載了表1中30種作物線粒體的ATP6序列。在表1作物的分類上，使用經典的以植物形態學特征為依據的克朗奎斯特分類法[13]。

表1 作物線粒體基因組

1.2 系統發育樹的構建

將下載得到的數據分別用ClustalX軟件進行匹配對齊，用MEGA6.06軟件中的鄰接（Neighbor-joining，NJ）距離法進行構樹[14]。NJ法有著許多模型參數選項，常用的Kimura 2-parameter模型對堿基的轉換和顛換率差異做了校正，但是假定了不同位點替換速率相等以及核苷酸頻率相等，這或許會導致一定的偏差。由π電子共振能來計算物種的系統發育距離在一定程度上考慮了核苷酸的替換頻率和速率；這種距離被定義為E距離，E=1-2c/（a+b），（a、b分別為被替換序列之間的π電子共振能之和，c為按位比較被替換序列之間相同堿基的π電子共振能之和，各堿基π電子共振能比值為A∶G∶C∶T= 0.32∶0.27∶0.23∶0.17），它對應群落間按堿基能量計算的群落相異性指數[15]。通過使用NJ法中的Kimura 2-parameter模型對表1中植物的ATP相關基因進行系統發育樹構建，并進行1 000次Bootstraps檢驗；同時亦使用E距離模型和最大似然（Maximum Likelihood，ML）法建樹作為對比參照。

2 結果與分析

用NJ法分別構建表1中30種作物線粒體基因ATP6的Kimura 2-parameter模型系統發育樹（圖1）、E距離模型系統發育樹（圖2）及最大似然法系統發育樹（圖3）。由圖1系統樹可以看出：與經典形態學分類結果一致，差別最明顯的單子葉作物和雙子葉作物被分為最大的兩類；所有相同目的作物被歸為一個分支，其中所有相同科的作物聚在一起后再與同目不同科的作物聚在一起，所有的6種十字花科物、3種藜科作物、3種葫蘆科作物、3種豆科作物、9種禾本科作物被聚為一個單系；但是堇菜目的番木瓜未和在其他堇菜目植物（葫蘆科）聚在一起，而是和鼠李目的葡萄聚在一起。圖2中ATP6的E距離系統發育樹與Kimura 2-parameter系統樹類似，都有著與經典形態學分類一致的較好的分類結果；在對堇菜目番木瓜和堇菜目葫蘆科植物的歸類上，同樣支持將兩者分為不同類。以NJ法的Kimura 2-parameter模型以及最大似然法對ATP6作圖，都顯示堇菜目番木瓜和堇菜目葫蘆科植物為不同類目，而目前較新的APGII[16]分類法已將番木瓜由堇菜目改為十字花目，與之前葫蘆科植物所屬堇菜目（現改為葫蘆目葫蘆科）區分開。

圖1 Kimura 2-parameter 模型構建的ATP6系統發育樹

圖2 E距離模型構建的ATP6系統發育樹

圖3 最大似然法構建的ATP6系統發育樹

3 討 論

由此看來，具有重要生物功能的ATP6能夠將既定作物正確分類，而且聚類結果較于傳統的形態學分類更符合較新的植物分類規則。線粒體ATP6編碼ATP合酶的a亞基，對ATP合酶生物學功能的正常運轉起著重大的作用，有著巨大的生物學分析潛力?，F已有學者運用MT-ATP6來對大西洋鰻魚進行物種形成分析[17]。

一直以來，對于植物物種的分類在不斷地發生改變，越來越多的科學家從一開始使用克朗奎斯特形態學分類法到現在逐漸傾向于較新的APGⅡ分類法，而APG也從第一版改編到第三版?；诰€粒體ATP6基因的系統發育分析結果符合現有植物學分類，或能給以后作物的分類乃至系統發育和物種起源等分析提供參考。

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（責任編輯：高國賦）

Phylogenetic Analysis of Crops with Mitochondrial ATP6 Gene Sequence

HU Xiao-tian1,2，XIANG Yan1,2，ZHANG Ke1,2，LIU Qi-yuan3，FAN Yan-jun1,2，ZHOU Wei1,2
（1. Hunan Key Laboratory for Biology and Control of Plant Diseases and Insect Pests, College of Plant Protection, Hunan AgriculturalUniversity,Changsha 410128,PRC; 2. Hunan Engineering & Technology Research Center for Bio-Agrochemical and Pharmaceutic Processing, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 3. Ministry of Education's Key Laboratory of Crop Physiology, Ecology and Genetic Breeding, College of Agronomy, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, PRC）

ATP6 encodes the subunit a of ATP synthase and plays an important role in the normal function of enzyme. The neighborjoining Kimura 2-parameter method, neighbor-joining E method and maximum likelihood method were used to explore the phylogenetic relationships of 30 various crops base on mitochondrial gene ATP6 in this study. The results showed that the phylogenetic relationships base on mitochondrial ATP6 among species of the given crops were consistent with present morphological classifcation. The mitochondrial genes ATP6 have a great potential in speciation history of crops.

crop; ATP synthase; ATP6 gene; phylogeny

Q949

：A

：1006-060X（2015）10-0001-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.10.001

2015-08-17

國家自然科學基金（31301388）；國家自然科學基金（31260350）；中國博士后特別資助項目（2015T80870）；中國博士后面上項目（2014M562109）；湖南省自然科學基金（14JJ3092）；湖南省科學技術廳科技計劃項目（2014GK3046）；江西省教育廳科技計劃項目（GJJ13275）；湖南農業大學大學生創新性實驗計劃項目（XCX14071）

胡曉天（1993-），男，浙江平湖市人，本科生，主要從事生物信息學研究。

周 瑋