新牧1號苜蓿抗逆相關基因MvNHX1啟動子表達載體的構建

代文俊，朱彥卓，晁朝霞，任燕萍

（新疆農業(yè)大學農業(yè)生物技術重點實驗室，新疆農業(yè)大學農學院，新疆 烏魯木齊 830052）

新牧1號苜蓿抗逆相關基因MvNHX1啟動子表達載體的構建

代文俊，朱彥卓，晁朝霞，任燕萍

（新疆農業(yè)大學農業(yè)生物技術重點實驗室，新疆農業(yè)大學農學院，新疆 烏魯木齊 830052）

為了進一步研究新牧1號苜蓿抗逆相關基因Mv N H X1啟動子的功能，采用雙酶切的方法，用核酸內切酶S acⅠ和N c oⅠ分別雙酶切p C AM B IA1304質粒和陽性重組質粒p E A S Y-T1-simple-pMv N H X1，然后回收目的片段。通過T4DN A連接酶將目的片段和空載體相連后獲得連接產物。將連接產物導入到宿主菌D H5α，通過畫板，卡那霉素篩選后挑單菌落搖菌。然后用菌液PC R及雙酶切鑒定該載體后，用凍融法將其導入農桿菌E H A105。結果表明，成功培養(yǎng)出含有抗逆相關基因Mv N H X1啟動子pMv N H X1∶G U S∶E H A105的菌落；成功構建出新的植物表達載體pMv N H X1∶G U S。

誘導型啟動子；Mv N H X1啟動子；表達載體構建

啟動子在基因表達調控過程中起著重要作用[1]。植物基因啟動子的克隆及其功能的研究有助于了解基因表達調控模式和信號傳遞途徑，同時可應用于基因工程中調控目的基因的表達。目前植物基因工程中廣泛應用的組成型啟動子能高效、非特異地啟動外源基因表達，外源基因在組成型啟動子的調控下在植物的所有生長發(fā)育階段和所有組織中都高效表達，但是這往往會造成植物的代謝負荷，從而影響植物的長勢和產量。因此，由于信號刺激而具有轉錄活性的誘導型啟動子和能夠驅動外源基因在植物組織器官中定時、定點表達的組織特異性啟動子已逐漸成為研究的熱點[2-3]。

以成功克隆的新牧1號苜蓿抗逆相關基因M vNHX1啟動子為研究對象[4]，采用分子生物學研究方法，構建由M vNHX1啟動子驅動的植物表達載體，為利用MvNHX1啟動子驅動GUS基因的表達，進而了解M vNHX1啟動子的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物表達載體pCAMBIA1304、大腸桿菌DH5α、農桿菌EHA105、限制性內切酶SacⅠ和NcoⅠ、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、引物等。

1.2 試驗方法

1.2.1 M vNHX1啟動子目的片段獲得 以含有目的片段的pEASY-T1-pMvNHX1質粒為模板，使用上游引物NS1（5’-CGAGCTCTTGGAAGCTGGCATGGAG GATG-3’）和下游引物NA1（5’-CATGCCATGGGG CAATGGGCACTGATGACTGG-3’）擴增得到帶有SacⅠ和NcoⅠ雙酶切位點的啟動子片段，回收并純化。

1.2.2 植物表達載體pMvNHX1:GUS構建 將植物表達載體pCAMBIA1304用SacⅠ和NcoⅠ雙酶切，去除CaMV35S啟動子片段。酶切后獲得的MvNHX1啟動子目的片段與酶切后的植物表達載體pCAMBI A1304進行連接反應，反應體系為25μL（10×T4Buffer為2.5μL，M vNHX1啟動子目的片段為6μL，pCAMBIA1304目的片段為5μL，T4 DNA連接酶為1μL，加水至25μL），16℃反應25 h。將連接后的植物表達載體pMvNHX1:GUS轉化到大腸桿菌中，涂抹于含有卡那霉素（50μg/m L）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)過夜，參照全式金質粒小提試劑盒說明書進行質粒DNA提取。使用菌液PCR和雙酶切鑒定構建出的新的植物表達載體。

1.2.3 植物表達載體pM vNHX1:GUS轉入農桿菌 首先活化農桿菌EHA 105至其OD600約為0.6，制備農桿菌感受態(tài)細胞，然后將重組質粒pMvNHX1::GUS轉入進感受態(tài)細胞中，接種于YEB固體平板上（含50 μg/mL卡那霉素和50μg/m L利福平），28℃培養(yǎng)24 h，待平板長出單菌落后挑取搖菌，進行菌液PCR和雙酶切鑒定。

2 結果與分析

2.1 植物表達載體的構建

用核酸內切酶 NcoⅠ和 SacⅠ分別雙酶切pCAMBIA1304質粒和陽性重組質粒 pEASY-T1-simple-pMvNHX1。然后回收目的片段，將目的片段和空載體相連后獲得連接產物。將連接產物導入到宿主菌Trans-T1，通過畫板，卡那霉素篩選后挑單菌落，搖菌和提質粒，最終用內切酶NcoⅠ和SacⅠ進行單雙酶切檢測，雙酶切產生約11 559 bp和1 378 bp的預期片段，單酶切產生約12 937 bp的預期片段（圖1）。研究表明，MvNHX1啟動子已成功插入到pCAMBI A1304上的多克隆位點，已成功構建出新的植物表達載體pM vNHX1:GUS。

圖1 植物表達載體pMvNHX1:GUS酶切電泳結果注：M1，D15000DN A標準分子質量；1，pMv N H X1:G U S雙酶切；2，pMv N H X1:G U S單酶切

2.2 含植物表達載體農桿菌陽性菌株的PCR檢測

對轉pMvNHX1:GUS的農桿菌質粒用MvNHX1啟動子的特異引物擴增出預期大小的條帶（圖2）。說明植物表達載體pMvNHX1:GUS都已成功地轉入到農桿菌EHA105菌株中。

圖2 農桿菌pM vNHX 1:GUS轉化子的PCR鑒定注：M，D2000DN A標準分子質量；1～3，Mv N H X1啟動子PC R擴增產物

3 結論與討論

以前期克隆得到的新牧1號苜蓿抗逆相關基因MvNHX1啟動子為研究對象，采用分子生物學研究方法，成功構建獲得由MvNHX1啟動子驅動的植物表達載體pMvNHX1:GUS，為利用農桿菌介導法將MvNHX1啟動子驅動GUS基因表達的植物表達載體轉入煙草中，通過GUS化學組織染色分析不同脅迫處理下GUS表達活性，進而研究MvNHX1啟動子的功能奠定基礎。

前期研究結果表明，新牧1號苜蓿受高鹽和干旱的誘導產生抗逆相關基因MvNHX1，因此，進一步采用基因工程技術，揭示新牧1號苜蓿MvNHX1誘導表達啟動子生物學功能，其結果不僅可為苜蓿轉基因工程提供可用的內源啟動子，為苜蓿啟動子研究奠定基礎，而且可豐富和拓寬耐鹽基因工程可用基因和啟動子資源庫，促進我國廣大鹽漬化地區(qū)的開發(fā)和利用。

[1]王 穎，麥維軍，梁承鄴，等.高等植物啟動子的研究進展[J].西北植物學報，2003，23：2040-2048.

[2]楊春霞，陳 英，黃敏仁，等.擬南芥逆境誘導性啟動子r d29A的克隆及活性檢測[J].南京林業(yè)大學學報，2008，32（1）：6-10.

[3]楊 梅，熊立仲.水稻干旱誘導型啟動子O s h o x24P的分離與鑒定[J].華中農業(yè)大學學報，2011，30（5）：525-531.

[4]楊云堯，任燕萍，蘇豫梅，等.新牧1號苜蓿兩個抗逆相關基因啟動子的克隆及分析[J].草業(yè)科學，2012，29（12）：1887-1893.

（責任編輯：盧紅玲）

Construction of Plant Expression Vector of M vNHX1 Promoter in M.varia Xinmu1

DAIWen-jun，ZHU Yan-zhuo，CHAO Zhao-xia，REN Yan-ping
（College of Agriculture,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,PRC;Key Lab of Agricultural Biotechnology, Xinjiang Agricultural University,Urumqi830052,PRC）

In order to clarify stress-inducible M vNHX1 promoter function in M edicago varia X inmu 1,the M vNHX 1 promoter and plant expression vector pCAMBIA1304 were digested w ith SacⅠand NcoⅠ by using co-digestion.Then the purified MvNHX1 promoter fragment was connected to the plant expression vector pCAMBIA1304 w ithout 35S promoter by T4 DNA ligase.Finally the pCAMBIA1304 containing M vNHX1 promoterwas successfully transferred into Agrobacterium tumefaciens EHA105.The transfered A. tumefaciens EHA105 w ith pM vNHX 1∶GUSwas identified by PCR and enzyme digestion.

inducible promoter;MvNHX1 promoter;construction of plantexpression vector

Q78

A

1006-060X（2015）01-0004-02

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.01.002

2014-10-24

新疆農業(yè)大學大學生創(chuàng)新項目（jqz tp72013009）

代文俊（1991-），女，河南沈丘縣人，在讀本科，主要學科專業(yè)為生物技術。

任燕萍