一種新型抗菌活性物質的初步研究

易凌霄，陳智勇，董 偉

（1.湖南農業大學國際學院，湖南 長沙410128；2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙410128；3.湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙410128）

一種新型抗菌活性物質的初步研究

易凌霄1，陳智勇2，董 偉3

（1.湖南農業大學國際學院，湖南 長沙410128；2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙410128；3.湖南農業大學動物醫學院，湖南 長沙410128）

應用高速離心和高效液相色譜法分離純化技術，從大腸桿菌細胞裂解液中獲得了一種新型的天然抗菌活性物質。體外抑菌試驗結果顯示：該活性物質對金色葡萄球菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、青枯病菌的最小抑菌濃度（MI C） 分別為2.5μg/m l、5μg/m l、0.625μg/m l、0.625μg/ml、1.25μg/ml，最低殺菌濃度（M B C）分別為5μg/ml、5μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、2.5μg/ml；化學法和質譜法進行成分鑒定的結果證明該抗菌活性物質為生物堿；對模式植物擬南芥的安全性評價結果顯示該抗菌活性物質對植物的生長發育無抑制作用和不良影響。上述實驗結果表明：該抗菌活性物質是一種廣譜、高效、安全的新型抗菌天然產物，具有可替代抗生素類藥物的開發利用前景。

抗菌活性物質；生物堿；大腸桿菌；青枯病；擬南芥

細菌病害是農業生產的主要災害之一，常給動物養殖和植物栽培帶來極大的損失。目前生產上對細菌性病害的防治主要依靠抗生素類藥物。由于抗生素類藥物的大量長期使用，導致了耐藥性細菌甚至超級細菌的出現，給動植物細菌病的防治帶來了嚴重挑戰[1]。因此，開發新的抗菌藥物，突破抗生素耐藥性難題，已成為當前世界關注的焦點和研究的熱點。

從動植物和微生物中提取天然抗菌活性物質是尋找新型抗菌藥物的重要途徑，因為天然抗菌活性物質具有高效、低毒、無污染和來源廣等特點，可有效抑制細菌生長，同時也不會對環境造成污染，或導致產生抗藥性，而且生產方便、研發周期短[2]。近年來，已有不少學者從多種生物體內分離提取到了天然的抗菌活性物質[3-8]，但還未見從大腸桿菌中分離提取天然抗菌活性物質的研究報道。大腸桿菌是常用的實驗細菌，來源廣泛，易于培養，而且遺傳背景清楚，如能從大腸桿菌細胞中分離提取到天然的抗菌活性物質，將有重要的理論研究意義。

另外，在已有的關于天然抗菌活性物質的報道中，還沒有涉及到對植物青枯病菌防治的研究。實際上，在作物栽培生產中，青枯病的危害是相當嚴重的，由Ralstonia solanacearum(Sm ith)Yabuuchi引起的植物細菌性青枯病在熱帶和亞熱帶地區普遍發生，是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最嚴重的植物土傳病害之一，而目前對青枯病的防治方法仍然主要是使用抗生素[9-12]。因此，研發出抗植物青枯病的天然的抗菌活性物質，在農業生產上有著極為重要的應用價值。

試驗選擇大腸桿菌為天然抗菌活性物質的供體材料，用堿裂解法裂解大腸桿菌細胞，通過高速離心和高效液相色譜分離純化細胞內容物，進行體外抑菌試驗，篩選抗菌天然活性物質，并用化學法和質譜法對其成分進行鑒定，對抗菌活性物質進行安全性評價，旨在獲得一種在農業生產上有應用價值，特別是對植物青枯病有良好防治效果的新型天然抗菌活性物質，以替代目前仍在大量使用的抗生素類藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 大腸桿菌 (E.coli)C44103；鏈 球菌(streptococcus)O1026；巴氏桿菌(pasteurellamultocid) C44-1；金葡菌(staphylococcus aureus)C26112，購自中國獸藥監察所，并由實驗室保存。青枯病菌種由王國梁教授惠贈。

1.1.2 培養基與試劑 LB培養基、1/2MS培養基、NA培養基、溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、乙腈、濃硫酸、茚三酮、碘-碘化鉀、苦味酸、磷鉬酸試劑﹑硅鎢酸試劑、碘化汞鉀試劑、碳酸鈉、乙醚、硝酸銀的氨溶液、蘇丹Ⅳ溶液。配置以上培養基和溶液的試劑均為國產分析純，以上培養基和溶液均由實驗室配置并保存。Wst-1染液（冷凍避光保存）。

1.1.3 植物種子 模式植物擬南芥野生型種子由夏石頭教授惠贈。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗菌活性物質的分離與篩選 （1）大腸桿菌的培養：在無菌操作臺上取大腸桿菌實驗菌株單菌落接種至LB液體培養基中，置37℃恒溫培養箱中震動培養24 h。（2）大腸桿菌細胞裂解：參考江歡歡的方法[13]進行，并作一定調整。（3）大腸桿菌細胞裂解物的分級離心：取大腸桿菌細胞裂解液，用1000 r/m in、2000 r/m in、3 000 r/m in、4 000 r/m in、4 000 r/m in、5 000 r/m in、6 000 r/m in、7 000 r/m in、8 000 r/m in、9 000 r/m in、10 000 r/m in的10個梯度，分別離心15m in，同時分別收集各離心梯度的沉淀。（4）抗菌活性成分的篩選：采用MTT方法測定各級離心沉淀的抗菌活性。將各級離心沉淀分別置于50℃下烘干，將大腸桿菌標準菌株培養后進行活菌計數，并稀釋至106個/m L；取96孔細胞培養板，每孔加入100μL的稀釋菌液，在加了菌液的孔中再分別加入 15μL各級沉淀水溶液（1mg/m L），各樣品做3個平行孔；放入37℃恒溫培養箱中培養1 d后取出細胞培養板，在每孔中加入10 μLWst染液，后再放入培養箱中培養1 h；在酶標儀490 nm下檢測OD值，并計算3個平行孔的平均OD值，OD值低的孔中細菌生長受到抑制，由此篩選出有抗菌活性的沉淀。（5）高效液相分離：色譜柱為unitary C18，5 um，4.6mm×250mm；流動相為乙腈；洗脫梯度為0～12m in、乙腈10%～95%；12～26m in、95%乙腈；26～30m in、乙腈95%～100%。

進樣量為30μL；流速為1m L/m in；檢測波長為254 nm。每2m in接一管液體，共接15管，每管2m L，依此反復9次。

1.2.2 抗菌活性物質的成分鑒定 按下列方法鑒定和鑒別。

（1）糖類鑒別采用Molish試驗，參考李孝棟和賈林的方法[14-15]。

（2）蛋白質鑒定采用茚三酮試驗，參考許文彥等的方法[16]。

（3）酮、醛的鑒別，參考了趙蓮的方法[17]。

（4）脂類的鑒定，參考了王秀麗等的方法[18]。

（5）生物堿類成分的鑒別：①取上備酸水浸液四份（每份1m L左右即可），分別滴加碘-碘化鉀﹑苦味酸試劑﹑磷鉬酸試劑﹑硅鎢酸試劑。若四者均有或大多有沉淀反應，表明該樣品可能含有生物堿，再進行下項試驗。②取上備其余酸水浸液，加Na2CO3溶液呈堿性，置分液漏斗中，加入乙醚約10m L振搖，靜置后分出醚層，再用乙醚3m L，如前萃取，合并醚液。將乙醚液置分液漏斗中，加酸水液10m L振搖，靜置分層，分出酸水液，再以酸水液5m L如前提取，合并酸水液，如此酸提液4份，分別作以下沉淀反應：a．碘化汞鉀試劑（Mayer試劑）：酸水提液滴加碘化汞鉀試劑，產生白色沉淀。b．硅鎢酸試劑：酸水提取液滴加硅鎢酸試劑產生淡黃色或灰白色沉淀。此酸水提液與以上3種試劑產生沉淀反應，即本樣品含有生物堿。

（6）能譜檢測：用高效液相分離前的粗提大腸桿菌抗菌活性物質進行能譜分析。

（7）質譜檢測：用高效液相分離后的大腸桿菌抗菌活性物質進行質譜分析。

1.2.3 抗菌活性物質體外抗菌活性檢測 （1）抗菌活性物質最低抑菌濃度(M IC)的測定：分別取病原菌大腸桿菌、巴氏桿菌、金色葡萄球菌、鏈球菌及菌青枯病菌單菌落進行液體培養，并將細菌培養液稀釋至106個/m l濃度。然后生理鹽水制成依此稀釋10倍的1～10號管混合液；從各管中分別取稀釋的菌液0.1m L均勻涂布在固體培養基上，恒溫培養24 h后，對菌落進行計數。取5支滅菌試管，分別加入1m L液體培養基，然后移取1m L經MTT篩選出的具有抗菌活性的組分液體（20μg/m L）加入1號試管，混勻，從1號試管中移取1m L液體至2號管中，混勻，依次稀釋到5號管，從5號管中取出1m L液體棄去。并分別于1，2，3，4號管中加入100μL的菌液（106個/m l濃度）。另取一試管，加入1m L LB液體培養基，100μL菌液作為對照。將稀釋好的溶液置于35℃的恒溫培養箱中培養24 h，觀察各試管的細菌生長數量，確定最低抑菌濃度。（2）最低殺菌濃度(MBC)的測定：取上述藥物最低抑菌濃度以上未見細菌生長的各孔培養物，分別吸取100μL，移種至不含藥的平皿瓊脂培養基上，輕輕推開藥液，置37℃培養過夜，觀察有無菌生長，計數少于5個菌落者即為該藥的最低殺菌濃度。

1.2.4 抗菌活性物質對擬南芥組織培養的影響 在無菌操作臺上將滅菌后的擬南芥野生型種子接入1/2 MS培養基中，25℃光照培養4周后成苗。配置1/2 MS培養基，設置三組，A組為空白對照，B組加入低濃度2%的抗菌活性物質，C組加入高濃度5%的抗菌活性物質，每組設置8個重復。將健壯的擬南芥植株接入上述3組培養基，觀察其生長情況。

2 結果與分析

2.1 抗菌活性物質的離心分離與MTT檢測結果

大腸桿菌堿裂解液分別經10個不同梯度的離心后，得到10種不同分子量的沉淀物，將這些不同組分的沉淀物分別用MTT法進行抗菌活性測定，結果顯示：在6 000 r/m in梯度離心下所得沉淀物無抗菌活性，在7 000 r/m in梯度離心下所得沉淀物，其檢測孔中的細菌濃度低，透光性好，490 nm下的OD值最低，說明該組分的物質能顯著抑制實驗細菌的生長，是一種抗菌活性物質。檢測結果見圖1。

圖1 堿裂解法不同離心力粗提物MTT結果

大腸桿菌堿裂解液經7 000 r/m in離心所獲得得沉淀物（粗提取物）于50℃下烘干后，得到棕黃色的粉末顆粒物（見圖2）。

圖2 大腸桿菌抗菌活性物質粗品

2.2 抗菌活性物質高效液相分離與MTT檢測結果

對在7 000 r/m in梯度離心下所得沉淀的水溶液，進行高效液相分離，并對不同洗脫時段的洗脫液進行MTT抗菌活性檢測。結果顯示：在高效液相色譜分離出的洗脫液中，第15～16m in的吸光度平均值最小，活細菌數量最少，說明其抗菌活性最強（見圖3）。

圖3 高效液相分離的MTT的活性檢測結果

2.3 抗菌活性物質成分鑒定結果

將在7 000 r/m in梯度離心下所得的抗菌活性沉淀物分別進行糖類、蛋白質、酮類、脂類和生物堿鑒定。Molish實驗顯示沒有紫紅色環出現，證明該抗菌活性物質不含糖類成分；茚三酮顯色反應結果未呈現出藍紫色，說明該抗菌活性物質中不含有蛋白質成分；銀鏡實驗證明該抗菌活性物質中不含有酮、醛類成分；生物堿鑒定結果顯示，在鑒別1的四種生物堿鑒定試劑反應中，有3種反應出現了沉淀物，在鑒別2的4種生物堿鑒定試劑反應中，有兩種反應出現了沉淀物，結果表明該抗菌活性物質中含生物堿（圖4）。

圖4 抗菌活性物質鑒定結果注：左起一管是糖類鑒定結果，二管是蛋白質鑒定結果，三至六是生物堿鑒定結果，七是酮類鑒定結果。

2.4 抗菌活性物質抑菌實驗結果

對在高效液相色譜第15～16m in洗脫分離出的抗性活性物質進行一系列抑菌實驗，與對照相比較，發現其對大腸桿菌、鏈球菌、巴氏桿菌、青枯病菌均有明顯的抑制作用。該抗菌活性物質對金色葡萄球菌、大腸桿菌、巴氏桿菌、鏈球菌、青枯病菌的最小抑菌濃度（M IC）分別為2.5μg/m L、5μg/m L、0.625μg/m L、0.625μg/m L、1.25μg/m L，最低殺菌濃度（MBC）分別為5μg/m L、5μg/m L、1.25μg/m L、2.5μg/m L、2.5μg/m L （圖5-圖8）。

圖5 大腸桿菌在未加抗性物質（左）和加抗性物質（右）培育基中的生長狀況

圖6 巴氏桿菌在未加抗性物質（左）和加抗性物質（右）培育基中的生長狀況

圖7 鏈球菌在未加抗性物質（左）和加抗性物質（右）培育基中的生長狀況

圖8 青枯病菌在未加抗性物質（左）和加抗性物質（右）培育基中的生長狀況

2.5 抗菌活性物質對植物生長的影響

在擬南芥的培養基中加入不同濃度的該抗菌活性物質并設計空白對照，在接種后的一周和兩周后分別觀察擬南芥的生長情況，可以看出該抗菌活性物質對擬南芥對的生長沒有影響，見圖9。

圖9 抗菌活性物質對植物生長的影響A圖：左CK，中添加2%抗性物質，右添加5%抗性物質（接種7 d）；B圖：左CK，中添加2%抗性物質，右添加5%抗性物質（接種14 d）

3 討論

提取天然的抗菌活性物質來防治細菌病已經成為動植物抗菌制劑開發的新趨勢。從大腸桿菌中提取出抗菌活性物質是找尋抗菌藥物的一種新思路。試驗用MTT法分別檢測了大腸桿菌的培養液、全菌、大腸桿菌超聲波裂解物和大腸桿菌鹽裂解物，均未檢測到抗菌活性，證明只能通過堿裂解才能釋放出具有抗菌活性的大腸桿菌的結構成分，該成分應該是大腸桿菌中共有的結構成分，因試驗從標準菌株和分離菌株中均提取到該成分，活性并無差異。該活性物質的抗菌活性高，達到常規抗生素的抑殺菌效度。抗菌譜廣，對動物源性多種革蘭氏陰性菌和陽性菌具有顯著抗菌效果，尤其對豬源巴氏桿菌抑菌效果更高。對植物源病原菌青枯病菌的抑菌效果也較高。并且該物質耐高溫，結構穩定，對動植物毒副作用小，因此具有作為一種新抗菌藥物的開發應用的潛質。

該抗菌活性物質經初步鑒定為一種生物堿，這也與只能經堿裂解法提取該活性物質的結果相吻合。但到底是何種物質，本研究通過能譜檢測結果顯示，該活性物質中含量高的元素依次為C、O、Na和N，質譜鑒定仍為小分子混合物。目前，筆者正在做進一步分離純化和結構分析。另外，其抑菌的作用機制還有待進一步研究。

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（責任編輯：吳 婷）

Prelim inary Test on a New Type of Antibacterial Substance

YILing-xiao1，CHEN Zhi-yong2，DONGWei3
（1.International College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC;2.Biological Science and Technology College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC;3.Veterinary Medicine College,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,PRC）

Application of high-speed centrifugation and high-performance liquid chromatography to separation and purification obtained a new type of natural antibacterial substance from Escherichia coli cell.Against Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Pasteurella multocida,Streptococcus,Pseudomonas,solanacearum them inimal inhibitory concentration(MIC)was2.5μg/m l,5μg/m l,0.625μg/m l, 0.625 g/m l and 1.25 g/m l,theminimum bactericidal concentration(MBC)was 5 g/m l,5 g/m l,1.25 g/m l,2.5 g/m l,2.5 g/m l,respectively composition identification of chemicalmethod andmassspectrometry shows that the antibacterialactive substance alkaloids;and the safety evaluation on themodelplantArabidopsisshows that theantibacterialactive substance had no inhibitory and adverse effects on the grow th and developmentof plants.The experimental results show that the antibacterialactive substance is a broad-spectrum,high efficiency,safe antibacterialnaturalproduct,with theprospectof developmentand utilization ofalternativeantibiotics.

antibacterial substance; alkaloid; Escherichia coli; blight;Arabidopsis thaliana

S182

A

1006-060X（2015）01-0099-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2015.01.032

2015-01-16

廣東省科技廳資助項目（2012B020401012）

易凌霄（1994-），男，湖南長沙市人，在讀本科，主要學科專業為生物科學。

董 偉