蔞蒿抗腫瘤作用活性部位的篩選

段和祥 黃宇枚 王棟 楊毅生 程奇珍 羅文艷

1.江西省藥品檢驗檢測研究院江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西南昌330029；

2.南昌大學科學技術學院，江西南昌330029；3.南昌大學第四附屬醫院藥劑科，江西南昌330003

蔞蒿抗腫瘤作用活性部位的篩選

段和祥1黃宇枚2王棟1楊毅生1程奇珍1羅文艷3

1.江西省藥品檢驗檢測研究院江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西南昌330029；

2.南昌大學科學技術學院，江西南昌330029；3.南昌大學第四附屬醫院藥劑科，江西南昌330003

目的采用體內外抗腫瘤實驗方法，篩選蔞蒿抗腫瘤活性部位。方法以95%乙醇提取，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水飽和正丁醇提取，得不同的提取層。用四甲基偶氮唑藍（MTT）法篩選出對人肝癌細胞（HepG2）細胞有良好增殖抑制作用的活性部位，并通過荷瘤小鼠模型考察活性部位對實體瘤生長的影響。結果蔞蒿的乙酸乙酯層對細胞增殖有顯著的抑制作用，在10 g/L濃度時對細胞增殖抑制率為15.64%，當濃度為1000 g/L時對細胞增殖抑制率高達78.21%，其作用隨著質量濃度的增加而增強。蔞蒿的乙酸乙酯層也對荷瘤小鼠有顯著的抑制作用，當濃度為400 mg/kg時，對小鼠HepG2肉瘤的抑瘤率達71.63%。結論蔞蒿的乙酸乙酯層具有顯著的體內、外抗腫瘤活性。

蔞蒿曰抗腫瘤曰活性部位

腫瘤是以細胞異常增殖為特點的一類疾病，常在機體局部形成腫塊。腫瘤的種類繁多，且具有不同的生物學行為和臨床表現。有些腫瘤生長迅速，侵襲力強，可從原發部位擴散到身體其他部位，嚴重影響機體健康，我們稱之為惡性腫瘤，俗稱癌癥。它所帶來的醫療費用及對患者和親屬產生的心理壓力也是巨大的，是目前全球居民死亡率最高的疾病之一。

蔞蒿（Artemisia Selengensis Turcz.ex Bess.）為菊科蒿屬植物，別名蘆、蒿、蘆蒿、水蒿、荑蒿等[1]。《神農本草經》將蔞蒿列為上品[2]，《本草綱目》將其收于草部第15卷[3]，為多年生草本植物，全草入藥，性平、味甘，有止血消炎、鎮咳化痰、開胃健脾、散寒除濕等功效。沈夕坤等[4]藥理研究表明，蔞蒿可增強小鼠抗缺氧、抗疲勞、耐高溫、耐低溫能力，有較好的補益和免疫促進作用。張健等[5]從萎蒿葉中首次分離得到化合物11，13-dihydroatricarin，發現該化合物對B-16細胞（小鼠黑色素瘤細胞）和HL-60細胞（人原髓細胞白血病細胞）有顯著的抑制活性，在濃度為1×10-5mol/L時，抑瘤率均到達90%以上，并且隨著濃度的遞減，抑制作用也逐漸減弱。蔞蒿對痢疾桿菌、大腸埃希菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和多種真菌也均有良好的抑制作用[6]。目前關于蔞蒿的研究，主要集中在抗菌、抗氧化、降壓等活性物質基礎和藥理活性方面[7-13]，但蔞蒿抗腫瘤之功效，并未引起人們的足夠重視。本試驗對蔞蒿抗腫瘤的活性部位進行初步研究，為進一步篩選蔞蒿中抗腫瘤活性成分提供重要依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

N-1100旋轉蒸發儀（東京理化器械株式會社），AL104電子天平（梅特勒-托利多公司），NAPCO（美國Costar公司），VD53真空干燥箱（德國BIND公司），Synergguv超純水儀（法國Millipore公司），KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司），ST16R低溫離心機（ThermoFishier公司）。

1.2 材料

蔞蒿采自江西省九江市鄱陽湖畔，經江西省食品藥品檢驗所袁桂平主任中藥師鑒定為菊科蒿屬植物蔞蒿的全草。胰蛋白酶（中國食品藥品檢定所，批號：615-9605），小牛血清（杭州四季青生物材料有限公司）；RPMI 1640培養基（GIBCO）；二甲基亞砜（DMSO）、5-氟胞嘧啶（5-Fu）、四甲基偶氮唑藍（MTT）、環磷酰胺（CTX）均購于Sigma公司，其他所用試劑均為分析純。

1.3 細胞株及細胞培養

HepG2細胞來源于軍事醫學科學院放射與醫學輻射學研究所，于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養HepG2細胞，在含有10%新生牛血（不含抗生素）的改良Eagle培養基（DMEN）培養基中生長，每3～4天以0.25%胰蛋白酶進行消化傳代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.4 實驗動物

本實驗所用小鼠為SPF級昆明（KM）小鼠，雌雄各半，3～4周齡，體重18～22 g，動物合格證號：4300470 0005991，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供。

2 方法

2.1 樣品的制備

稱取鮮蔞蒿36 kg，切碎，晾干，得22 kg，加95%乙醇100 kg，回流提取2 h，放出回流液，藥渣再用95%乙醇100 kg，回流提取1.5 h，放出回流液，濾過，合并濾液，回收乙醇，濃縮至相對密度為1.05的流浸膏5 kg，加適量的水搖勻，得總提取物。該總提取物分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯與水飽和正丁醇提取，合并提取液，回收溶劑，依次得到石油醚層（85 g）、氯仿層（143 g）、乙酸乙酯層（261 g）和正丁醇層（776 g），備用。臨用前再用二甲基亞砜分別稀釋成10、100、1000 g/L。

2.2 細胞增殖抑制實驗

采用MTT法，取對數生長期細胞稀釋成1×104cells/mL，立即接種于96孔培養板上，每孔100μL，然后在規定的實驗孔中加入不同濃度的樣品培養基，每個平行3孔，對照組（5-Fu）加等體積溶劑，置37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱中培養96 h，然后以3000 r/min速度離心5 min，每孔加0.2 mL新鮮配制的含有0.2 mL MTT的無血清培養基，在37℃繼續培養4 h，再離心，倒出上清液，加0.2 mL二甲基亞砜溶解MTT甲臜沉淀，超聲5 min，混勻，在酶標儀上于570 nm的波長處測定吸光度（A）。按（1-A樣品組/A對照組）× 100%計算細胞增殖抑制率。

2.3 抗腫瘤活性體內試驗

選用體重18～22 g的KM小鼠50只和生長良好的HepG2細胞，將HepG2細胞制成細胞懸液，接種于小鼠右側腋部皮下，約5×106個細胞/只。隨機分成5組，每組10只，接種24 h后開始給藥。其中，乙酸乙酯層高、中、低劑量組（100、200、400 mg/kg），每日灌胃給藥1次，共14次；環磷酰胺（CTX）陽性對照組腹腔注射給藥（30 mg/kg），第1、8天給藥，共給藥2次；另設空白對照組，給予等體積生理鹽水。停藥后24 h處死動物，稱體重、瘤重，計算各組平均瘤重。按下列公式計算腫瘤抑制率：抑瘤率=（1-治療組平均瘤重/空白對照組平均瘤重）×100%。

2.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 19.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 蔞蒿不同提取層對細胞增殖的抑制作用

結果表明，四種提取層對HepG2細胞增殖均有一定程度的抑制作用，其中，乙酸乙酯層的抑制作用最強，并且隨著濃度的遞增，抑制作用也逐漸增強，提示蔞蒿的乙酸乙酯層對腫瘤細胞具有較強的細胞毒作用。見表1。

3.2 乙酸乙酯層的抑瘤作用

結果表明，乙酸乙酯層表現出較強的腫瘤抑制作用，并且隨著給藥劑量的增加，瘤重逐漸下降，說明抑瘤率顯著增強。再次確定了乙酸乙酯層為抗腫瘤的有效部位。見表2。

4 討論

本實驗對蔞蒿4種提取層進行了體外抗腫瘤細胞毒性試驗，篩選出對HepG2有較好的細胞增殖抑制作用的有效部位。結果，乙酸乙酯層在1000 g/L時細胞增殖抑制率可達78.21%，說明乙酸乙酯層為其有效部位。石油醚層、氯仿層、水飽和正丁醇層對HepG2細胞增殖也有一定的抑制作用。體內抗腫瘤結果顯示，乙酸乙酯層在100 mg/kg對小鼠HepG2肉瘤的抑制率為37.21%；當濃度增至400 mg/kg時，抑瘤率高達71.63%，說明乙酸乙酯層對HepG2細胞增殖有顯著的抑制作用，并對小鼠移植性HepG2瘤有較強的抑制作用，隨著給藥劑量的增加，瘤重逐漸下降，抑瘤率明顯升高。

表1 不同提取層細胞增殖抑制率比較

表2 乙酸乙酯層對小鼠HepG2肉瘤的抑制作用（x±s，n=10）

抗腫瘤藥物也是臨床藥物治療中使用量較大的一類，在所有類別藥物的不良反應中抗腫瘤藥物不良反應報告占了很大比例[14]。尋找天然抗腫瘤活性成分是抗癌藥物研究的一個重要途徑，天然藥物單體聯合西藥化療治療腫瘤疾病是又一重要途徑[15]，利用這些天然活性物質進行結構修飾和優化，提高活性強度和選擇性，改善物理化學性質和代謝動力學性質，是另一重要途徑[16-17]。

鑒于蒿屬植物在抗腫瘤方面的廣泛研究與應用[18-28]，對蔞蒿抗腫瘤活性層進行分離、純化及結構鑒定，再進行體外、體內試驗，比較活性成分與抗腫瘤作用二者之間的量效和構效關系，為最終闡明蔞蒿的抗腫瘤活性化學物質基礎，得到一系列抗腫瘤活性的活性成分，同時為研究和開發具有自主知識產權的高效低毒抗腫瘤藥奠定基礎。

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Screening of antitumor active fractions from Artemisia Selengensis Turcz.

DUANHexiang1HUANGYumei2WANGDong1YANGYisheng1CHENGQizhen1LUOWenyan3
1.Jiangxi Institute for Drug Control,Jiangxi Provincial Engineering Research Center for Drug and Medical Device Quality,Jiangxi Province,Nanchang 330029,China;2.College of Science and Technology,Nanchang University,Jiangxi Province,Nanchang 330029,China;3.Department of Pharmacy,the Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University, Jiangxi Province,Nanchang 330003,China

ObjectiveTo screen the antitumor active fraction from Artemisia selengensis Turcz.by antitumor experimental method in vitro and in vivo.MethodsArtemisia selengensis Turcz.were extracted with 95%ethanol eluent, then petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,n-butyl alcohol extracted from the active fraction.The active fraction of good inhibitory effect on HepG2 cells proliferation was screened out by MTT assay.The inhibition effect of solid tumor by tumor-bearing mouse model was investigated.ResultsEthyl acetate extract of Artemisia selengensis Turcz.could significantly inhibit the growth for cell proliferation,the inhibition rate was 15.64%at 10 g/L.The inhibition rate was 78.21%at 1000 g/L.With the increase of the concentration,inhibiting action increased.Ethyl acetate extract of Artemisia selengensis Turcz.significant inhibition effect of solid tumor.When the concentration of 400 mg/kg for tumor bearing mouse inhibition rate was 71.63%.ConclusionEthyl acetate extract of Artemisia selengensis Turcz.has significant anti-tumor activity in vitro and in vivo.

Artemisia Selengensis Turcz.;Antitumor;Active fraction

R284.1

A

1673-7210（2015）04（c）-0013-04

2015-01-21本文編輯：衛軻）

江西省青年科學基金資助項目（編號20122BAB 215044）；江西省衛生廳中醫指導性計劃項目（編號2013B014）。

段和祥（1980.5-），男，碩士研究生；研究方向：中藥質量標準及物質基礎研究。

羅文艷（1980.5-），女，碩士研究生；研究方向：醫院藥學。