過氧化物酶體增殖體激活受體γ激動劑對炎癥狀態下人腎小球系膜細胞ABCA1表達的影響

劉華

首都醫科大學宣武醫院腎內科，北京100053

過氧化物酶體增殖體激活受體γ激動劑對炎癥狀態下人腎小球系膜細胞ABCA1表達的影響

劉華

首都醫科大學宣武醫院腎內科，北京100053

目的研究過氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPAR-γ）激動劑15-脫氧前列腺素J2（15d-PGJ2）對炎癥狀態下人腎小球系膜細胞（HMC）ATP結合盒轉運體A1（ABCA1）表達的影響，探討影響受體表達和延緩腎小球疾病進展的可能干預措施。方法培養的HMC隨機分為5組繼續培養24 h：空白組：普通培養的細胞；對照組：5 ng/mL白細胞介素-1β（IL-1β）；實驗組：5 ng/mL IL-1β+2.5μmol/L 15d-PGJ2，5 ng/mL IL-1β+5μmol/L 15d-PGJ2，5 ng/mL IL-1β+10μmol/L 15d-PGJ2，應用實時定量PCR法測定不同劑量PPAR-γ激動劑15d-PGJ2對IL-1β作用下HMC ABCA1 mRNA的影響。培養的HMC隨機分為4組繼續培養24 h：空白組：普通培養的細胞；對照組：5 ng/mL IL-1β；實驗組：5 ng/mL IL-1β+5μmol/L 15d-PGJ2，5 ng/mL IL-1β+10μmol/L 15d-PGJ2，應用Western印跡方法測定不同劑量15d-PGJ2對IL-1β誘導的ABCA1蛋白表達的影響。結果炎癥因子IL-1β能夠抑制HMC的ABCA1表達，15d-PGJ2呈劑量依賴性地增加IL-1β抑制的ABCA1 mRNA和蛋白表達。與對照組（5 ng/mL IL-1β）比較，2.5、5、10μmol/L 15d-PGJ2實驗組ABCA1 mRNA表達分別升高1.34、2.15、2.88倍，5、10μmol/L 15d-PGJ2實驗組ABCA1蛋白表達分別升高1.16、1.54倍。結論PPAR-γ激動劑15d-PGJ2劑量依賴性改善IL-1β對ABCA1 mRNA和蛋白表達的抑制，對炎癥導致的系膜細胞脂質失衡具有保護作用。

過氧化物酶體增殖體激活受體γ激動劑；系膜細胞；白細胞介素1β；ATP結合盒轉運體A1

越來越多的證據表明，腎小球硬化與動脈粥樣硬化有相似的病理改變和病理生理機制，脂質負荷細胞的表達是腎小球硬化和動脈粥樣硬化的特征性的改變。動脈粥樣硬化的實質是血管壁的慢性炎癥，因此炎癥因子與脂質共同作用是導致腎小球硬化發生發展的主要致病因素，研究炎癥如何在細胞水平影響膽固醇穩態是明確其介導腎臟損害的關鍵。細胞內脂質穩態涉及脂質的攝取和排出兩方面的平衡，ATP結合盒轉運體A1(ABCA1)是ATP結合盒轉運體（ABC）超家族的成員之一，在膽固醇逆轉運（RCT）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）生成的起始步驟中起重要作用，具有抗早期動脈粥樣硬化的功能[1]。過氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPAR-γ）是核激素受體超家族成員之一，在多種轉錄調控的細胞行為中都發揮重要作用，但是否影響炎癥狀態下系膜細胞內膽固醇穩態的相關研究較少。本實驗旨在揭示PPAR-γ激動劑在炎癥因子白細胞介素-1β（IL-1β）存在情況下對ABCA1表達的影響，探討影響受體表達和延緩腎小球疾病進展可能的干預措施。

1 材料與方法

1.1 材料

轉染T-SV40和H-ras癌基因的人腎小球系膜細胞株（HMCL）由英國Royal Free Hospital腎臟病中心RUAN Xiongzhong教授惠贈。RPMI-1640培養液及胎牛血清（FBS）（Gibco，U.S.A）。IL-1β（R&D，England），Ox-LDL（中國醫學科學院基礎所），ABCA1抗體（Novus，U.S.A）溶于0.5 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），分裝-70℃保存。PCR反應體系、逆轉錄酶（MMLV）緩沖液（Promege，U.S.A），dNTP、Oligo（dT）、引物均由上海生工生物工程公司合成，ABCA1引物序列：上游5'-ATTCGCTCTGAGATGAGCACCA-3'；下游5'-TTTCAAGCGGGCAT AGAACCA-3'。GAPDH引物序列：上游5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'下游5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'。15d-PGJ2：15-deoxy-Δ12，14-Prostaglandin J2（Calbiochem，U.S.A），化學分子式C20H28O3，溶于二甲基亞砜（DMSO），貯液濃度為10 mmol/L分裝，-20℃凍存備用。工作液DMSO終濃度為0.1%（V/V）。

1.2 HMC細胞的培養和鑒定

用10%FCS的RPMI1640細胞培養液在37℃，5%CO2培養箱中孵育培養HMCL細胞，以0.01 mol/L PBS沖洗細胞，0.25%胰蛋白酶/0.025%乙二胺四乙酸（EDTA）消化，10%FCS的RPMI1640培養液懸浮細胞傳代培養。間接免疫熒光法檢測：胞漿Actin、CollagenⅣ、Fibronnectin及Vimentin染色陽性，Cytokeratin、Ⅷ因子染色陰性。

1.3 15d-PGJ2的細胞毒性試驗細胞形態學觀察

①細胞形態學觀察。靜止細胞后分別換用含終濃度為0、2.5、5、10、15、20μmol/L 15d-PGJ2的0.2% FCS RPMI1640培養基培養24 h，40倍相差顯微鏡下觀察HMC細胞形態的改變。②錐蟲藍排斥試驗。分組方法同上，培養24 h收集各組細胞，PBS輕洗，胰酶消化后離心，細胞沉淀用NS制成懸液，錐蟲藍染色，隨機計數5個視野所有細胞。死亡細胞百分數以核藍染的細胞數占總細胞數的百分比表示。③LDH釋放試驗。分組同上，培養24 h收集各組細胞。不含藥物的6孔細胞設為低水平對照組，高水平對照組于實驗前加入200μL 1%Triton破壞細胞。各孔取100μL上清加入100μL反應混合物，室溫避光30 min，不含細胞的培養液校零，酶標儀490 nm波長檢測。細胞毒性指數=（實驗組OD值-低水平對照組OD值）/（高水平對照組OD值-低水平對照組OD值）×100%，即為細胞死亡百分數。

1.4 實時PCR檢測ABCA1 mRNA表達

15d-PGJ2對IL-1β誘導的ABCA1 mRNA表達的影響：培養細胞靜止后，40μg/mL Ox-LDL預先孵育24 h，隨機分為5組，每組3皿，空白組：普通培養的細胞、對照組：5 ng/mL IL-1β及3個實驗組：5 ng/mL IL-1β+2.5μmol/L 15d-PGJ2，5 ng/mL IL-1β+5μmol/L 15d-PGJ2，5 ng/mL IL-1β+10μmol/L 15d-PGJ2。37℃培養24 h收獲細胞，提取總RNA，合成cDNA，25μL反應體系PCR擴增：DEPC水15μL，引物（P1+P2）1μL，RT產物2μL，SYBER GreenⅠ染料12.5μL，95℃10 s，95℃15 s，60℃30 s，共擴增40～50個循環。

1.5 Western印跡檢測ABCA1蛋白表達

15d-PGJ2對IL-1β誘導的ABCA1蛋白表達的影響：培養細胞靜止后，40μg/mL Ox-LDL預先孵育24 h，隨機分為4組，每組3皿，空白組：普通培養的細胞，對照組：5 ng/mL IL-1β，實驗組：5 ng/mL IL-1β+ 5μmol/L 15d-PGJ2，5 ng/mL IL-1β+10μmol/L 15d-PGJ2，37℃培養24 h收獲細胞，提取總蛋白。上樣蛋白質250μg，電泳、轉膜5 h，封閉緩沖液過夜，1∶600一抗與膜孵育，室溫緩慢振蕩2 h，1∶6000二抗室溫緩慢振蕩1 h，洗膜，ECL顯影。

1.6 統計學方法

采用SPSS 11.0統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 15d-PGJ2的細胞毒性試驗

本實驗選用15d-PGJ2工作濃度為0～10μmol/L，在此范圍內細胞死亡率＜5%，對細胞無明顯毒性作用。見表1。

表1 不同15d-PGJ2濃度組的細胞毒性試驗細胞死亡率（%，n=6）

2.1.1 細胞形態學觀察相差顯微鏡觀察結果顯示，2.5～10μmol/L濃度組各組與對照組比較，細胞形態無明顯改變。15μmol/L組細胞形態不規則，少量細胞漂浮、死亡，20μmol/L組可見大量細胞死亡。

2.1.2 錐蟲藍排斥試驗細胞的死亡率隨著藥物作用濃度的增加而升高，2.5～10μmol/L濃度各組細胞死亡率分別為1.26%、2.85%、3.86%，15～20μmol/L濃度組細胞死亡率分別為16.78%、31.25%。見圖1。

2.1.3 LDH釋放試驗藥物的細胞毒性呈劑量依賴性，2.5～10μmol/L濃度各組細胞死亡率分別為1.75%、3.26%、4.17%，15～20μmol/L 15d-PGJ2導致的細胞死亡率分別達19.83%、41.08%。見圖1。

圖1 15 d-PGJ2的細胞毒性試驗

2.2 15d-PGJ2對IL-1β誘導的ABCA1表達的影響

2.2.1 15d-PGJ2對IL-1β誘導的ABCA1 mRNA表達的影響5 ng/mL IL-1β作用于細胞24 h與普通培養的空白組比較，能夠降低ABCA1 mRNA表達為0.195倍（P＜0.01），15d-PGJ2呈劑量依賴性的增加IL-1β抑制的ABCA1 mRNA表達。與單純5 ng/mL IL-1β對照組比較，2.5μmol/L 15d-PGJ2濃度研究組細胞ABCA1 mRNA表達升高1.34倍（P＜0.05），5、 10μmol/L濃度研究組細胞ABCA1 mRNA分別升高2.15、2.88倍（P＜0.01）。見圖2。

圖2 12 d-PGJ2對IL-1β誘導的ABCA1mRNA表達的影響

2.2.2 15d-PGJ2對IL-1β誘導的ABCA1蛋白表達的影響5 ng/mL IL-1β作用于細胞24 h與普通培養的空白組比較，能夠降低ABCA1蛋白表達為0.583倍（P＜0.01），15d-PGJ2呈劑量依賴性地增加IL-1β抑制的ABCA1蛋白的表達。與單純5 ng/mL IL-1β對照組比較，5μmol/L 15d-PGJ2濃度研究組細胞ABCA1蛋白表達升高為1.16倍（P＜0.05），10μmol/L 15d-PGJ2濃度研究組細胞ABCA1蛋白表達升高為1.54倍（P＜0.01）。見圖3。

圖3 15d-PGJCF LI-1β誘導的ABCA1蛋白表達的影響

3 討論

高脂血癥與腎臟疾病進展密切相關，它不僅是許多腎臟疾病常見的臨床表現，脂代謝異常本身也參與了腎臟病的進展。越來越多的證據表明腎小球硬化與動脈粥樣硬化有相似的病理改變和病理生理機制，血管動脈粥樣硬化實質是一個慢性炎癥的過程，而炎性反應又是造成腎臟組織損傷的主要機制，因此炎癥因子與脂質參與動脈粥樣硬化和腎小球硬化的形成，炎癥加重脂質失調導致的腎損害是腎小球硬化和腎病進展的重要因素，研究炎癥如何在細胞水平影響膽固醇穩態是明確脂質介導的動脈粥樣硬化和腎臟損害的關鍵。

細胞內脂質穩態涉及脂質的攝取、合成、外流代謝多方面的平衡，很多因素影響動脈粥樣硬化部位細胞對脂質的攝取和降解，受體表達變化是可能的調控機制。ABCA1在膽固醇逆轉運和高密度脂蛋白膽固醇生成的起始步驟中起重要作用。研究發現，人類動脈粥樣硬化區的ABCA1基因表達明顯上調，且病例組巨噬細胞來源的泡沫細胞中ABCA1表達是對照組的2倍，表明ABCA1可使巨噬細胞清除過多的膽固醇，增加循環HDL-C水平，發揮抗動脈粥樣硬化的作用[2]。腎小球硬化的特征是巨噬細胞和系膜細胞轉化來的泡沫細胞的存在，炎癥因子可以降低人腎小球系膜細胞ABCA1表達，抑制ABCA1途徑介導的脂質排出[3]，從而大大超過其清除能力而使之最終變成泡沫細胞。本研究發現IL-1β降低系膜細胞ABCA1蛋白和ABCA1 mRNA表達，因此炎癥因子可以通過抑制ABCA1的表達降低脂質的排出，從而導致細胞內膽固醇的失衡使其變成泡沫細胞，加重腎小球硬化和腎病的進展。

由于ABCA1在膽固醇逆向轉運中發揮重要作用，因此調控其基因的表達對于膽固醇的動態平衡尤為關鍵。ABCA1基因的轉錄調節受多種因素影響，其中以核激素受體超家族的轉錄調節最為重要。PPAR-γ是一類由配體激活的核轉錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族成員，是糖代謝和脂肪生成的主要調節者，在改善血脂、減輕炎性反應、提高胰島素敏感性等多種病理過程中發揮重要作用，PPAR-γ活性失調與多種疾病如肥胖、糖脂代謝、炎性反應、血管疾病有關[4]。PPAR-γ激動劑對肥胖人群具有抗動脈粥樣硬化作用[5]，在2型糖尿病和肥胖小鼠模型中，PPAR-γ部分激動劑替米沙坦，改善糖尿病血管病變[6]。研究表明，PPAR-γ超表達可以增強巨噬細胞膽固醇流出，從而減弱ApoE缺陷的大鼠的動脈粥樣硬化[7]。

大量研究表明，PPAR-γ可通過調控ABCA1的表達，發揮抗動脈粥樣硬化的保護作用。在動脈粥樣硬化的發生發展中，PPAR-γ通過核受體超家族成員肝X受體d（LXRα）上調ABCA1的表達，介導膽固醇外流和脂質轉運的基因的表達，促進膽固醇流出及血漿轉運，降低細胞內膽固醇含量，對細胞內膽固醇的調節發揮著至關重要的作用，因此PPAR-γ-LXRα-ABC通路在巨噬細胞膽固醇流出機制中具有重要作用[8]。Ozasa等[9]通過給予2型糖尿病患者服用PPAR-γ激動劑吡格列酮，并在離體條件下血清培養人巨噬細胞加入PPAR-γ激動劑吡格列酮，在體內研究和離體實驗發現ABCA1的表達增多，最后巨噬細胞通過ABCA1蛋白將胞內多余的膽固醇轉移至胞外。而抑制PPAR-γ表達可以促進動脈粥樣硬化。Hamblin等[10]研究發現，在PPAR-γ基因表達缺失的小鼠，血管內皮細胞VCAM-1的表達升高，動脈粥樣硬化等相關血管病變發生率增加，提示PPAR-γ的缺失可能與動脈粥樣硬化發生有著重要聯系。

PPAR-γ-肝臟X受體（LXRα）-ABC通路不但在巨噬細胞膽固醇流出機制中具有重要作用，能夠抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，還參與腎臟的脂質代謝。對低密度脂蛋白受體基因敲除糖尿病小鼠動脈的研究表明[11]，過氧化物酶體增殖物激活受體α/γ雙激動劑可以減輕小鼠脂質沉積和炎性反應，增加斑塊內膠原和α-SMA含量，有利于粥樣硬化斑塊穩定性。研究表明肝臟X受體（LXR-α）激動劑能提高兔系膜細胞ABCA1表達，并促進其介導的膽固醇流出，說明LXR-α通過ABCA1途徑參與調節腎臟脂質的平衡[12]。對慢性腎功能不全患者的研究發現，患者巨噬細胞內膽固醇含量增加與ABCA1表達下調有關[13]。

PPAR-γ主要通過抑制炎性反應來實現對動脈粥樣硬化的抑制作用，動脈粥樣硬化發生發展過程中產生大量的炎癥因子，人及動物粥樣斑塊炎性部位有PPAR-γ高度表達，活化的PPAR-γ通過限制巨噬細胞譜系促炎性反應，在炎性反應中發揮關鍵調節器的作用，而PPAR-γ在內皮細胞的缺失可促進動脈粥樣硬化的發生發展。PPAR-γ受體激動劑羅格列酮能減少巨噬細胞在血管壁的聚集，并抑制炎性反應和動脈粥樣硬化斑塊的形成。以上研究表明，激活的PPAR-γ在調節內皮功能、維持內皮結構完整、抑制動脈粥樣硬化發生發展的過程中發揮重要作用，有望成為治療動脈粥樣硬化的新靶點。

PPAR-γ的配體主要分為天然配體前列腺素J2（PGJ2）及其代謝產物，其中15d-PGJ2是PPAR-γ最有效的天然配體，PPAR-γ激動劑可改善肥胖導致的腎損傷[14]，PPAR-γ表達增加還可以減輕氧化損傷介導的腎臟衰老[15-18]。本研究發現PPAR-γ的激動劑天然配體15d-PGJ2，能夠劑量依賴性改善IL-1β抑制的ABCA1 mRNA和蛋白表達，抑制炎癥導致的脂質失調，在減緩炎癥加重的脂質腎損害中發揮關鍵的作用，推測可能延緩腎小球硬化和腎臟病進展。原發和繼發性腎小球腎炎中的炎性反應是腎臟組織損傷的主要機制之一，此研究結果探討PPARγ激動劑對炎癥在細胞水平所致脂質失衡的保護作用，可望為防治腎臟病進展尋找可能的干預措施，為PPARγ激動劑應用于腎臟疾病提供了一定的理論依據。

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Impact of peroxisome proliferator activated receptor-γagonist on the expression of ATP-binding cassette transporter A1 in human mesangial cell treated by interleukin-1β

LIU Hua
Department of Nephrology,Xuanwu Hospital,Capital Medical University,Beijing 100053,China

ObjectiveTo observe the protective effect of peroxisome proliferator activated receptor-γ(PPAR-γ)agonist for human mesangial cell(HMC)by the rgulation of ATP-binding cassette transporter A1(ABCA1)when stimulated by interleukin-1β(IL-1β)from progression of kidney diseases.MethodsHMC cultured for 24 hours were randomly divided into 5 groups:blank group:normal cultured cells;control group:cultured cells stimulated by dose of 5 ng/mL IL-1β;study group:cultured cells stimulated separately by 5 ng/mL IL-1β+2.5μmol/L 15d-PGJ2,5 ng/mL IL-1β+5 μmol/L 15d-PGJ2,5 ng/mL IL-β+10μmol/L 15d-PGJ2,the mRNA levels of ABCA1 were examined using Real-time PCR.Similarly,HMC cultured for 24 hours were randomly divided into 4 groups:blank group:normal cultured cells; control group:cultured cells stimulated by dose of 5 ng/mL IL-1β;study group:cultured cells stimulated separately by dose of 5 ng/mL IL-1β+5μmol/L 15d-PGJ2,5 ng/mL IL-β+10μmol/L 15d-PGJ2,the protein levels of ABCA1 were detected by Western blot.ResultsThe expression of ABCA1 mRNA and protein of HMC can be reduced by IL-1β while the inhibition expression could be increased by co-cultured with 15d-PGJ2 in a dose-dependent manner.When co-cultured with 2.5,5,10μmol/L dose of 15d-PGJ2,the expression of ABCA1 mRNA of HMC could be increased 1.34,2.15,2.88 times compared with the control group,while the expression of ABCA1 protein could be increased 1.16,1.54 times respectively when co-cultured with 5,10μmol/L dose of 15d-PGJ2,compared with the control group.ConclusionThe decreasing expression of ABCA1 stimulated by IL-1βcan be offset by 15d-PGJ2 in a dose-dependent manner which mean that PPAR-γagonist has a protective effect of HMC for dyslipidemia enhanced by inflammatory cytokines.

Peroxisome proliferator activated receptor-γagonist;Human mesangial cell;Interleukin-1β;ATP-binding cassette transporter A1

R692

A

1673-7210（2015）07（b）-0007-05

2015-03-30本文編輯：任念）

北京市科委資助項目（SCW2009-07）。