胃癌組織中一氧化氮合酶與整合素連接激酶的表達及意義

牛蕾雷麗

遼寧省阜新市中心醫院病理科，遼寧阜新123000

胃癌組織中一氧化氮合酶與整合素連接激酶的表達及意義

牛蕾雷麗

遼寧省阜新市中心醫院病理科，遼寧阜新123000

目的研究胃癌組織中微血管密度（MVD）的分布、一氧化氮合酶（NOS）與整合素連接激酶（ILK）表達及其與臨床病理特征的關系。探討MVD、一氧化氮合酶（iNOS）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、神經型一氧化氮合酶（nNOS）、ILK在胃癌浸潤、轉移中的意義及其相關性。方法應用免疫組化SABC染色檢測48例阜新市中心醫院2010年3月～2014年3月行根治性手術的胃癌組織標本中iNOS、eNOS、nNOS、ILK的表達情況，對腫瘤微血管以CD34抗體染色標記并檢測MVD值，并分析iNOS、eNOS、nNOS、ILK的相關性。結果iNOS、eNOS、nNOS、ILK在胃癌組織中的陽性表達率依次為72.92%（35/48）、81.25%（39/48）、83.33%（40/48）、37.5%（18/48）。不同病理類型的胃癌組織中iNOS、eNOS、nNOS、ILK的陽性表達率差異有統計學意義（P＜0.05）；TNMⅢ+Ⅳ期胃癌組織中的iNOS、ILK陽性表達。明顯高于TNMⅠ+Ⅱ（P＜0.05），但TNMⅢ+Ⅳ期與TNMⅠ+Ⅱ期胃癌組織中的eNOS、nNOS陽性表達。比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。不同病理類型的MVD值差異有統計學意義（P＜0.05），不同TNM分期的MVD值差異有統計學意義（P＜0.05）。iNOS、ILK陽性表達的胃癌組織中的MVD值均明顯高于陰性表達的MVD值，差異有統計學意義（P＜0.05），胃癌組織中iNOS與ILK的表達水平呈正相關（r= 0.375，P＜0.05）。結論iNOS、eNOS、nNOS、ILK的持續遞增式表達提示其可能參與了胃癌的生長、侵襲和轉移過程，構建了腫瘤發展的血管網。iNOS與ILK正性相關，可能通過iNOS信號轉導途徑啟動血管內皮生長因子的表達，促進腫瘤早期的血管發生和形成。

胃癌；微血管密度；整合素連接激酶；一氧化氮合酶

腫瘤組織中血管的生成是腫瘤生長、發生的主要因素，而惡性腫瘤微血管網的早期建立及快速生長是其快速侵襲和發展的原因。一氧化氮合酶（NOS）由誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、神經型一氧化氮合酶（nNOS）三種同工酶構成，作為一氧化氮（NO）合成的關健限速酶，其表達直接影響NO的生成。研究發現，催化NO生成的NOS活性的增高與腫瘤血管生成關系密切[1]。Hannigan等[2]于1996年率先在酵母菌雙雜合篩選系統中發現的一種蛋白激酶，它就是整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）。它可以調節諸多細胞的生長、分裂、增殖、存活、遷移和侵襲，在血管形成的化學信號傳導中起著重要傳導調控作用[3]。本研究通過研究胃癌中NOS與ILK的表達和腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）的高低，并分析其相關性，探討其在腫瘤的生長過程中對血管的協同作用及其在腫瘤轉移過程中的影響。現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取阜新市中心醫院2010年3月～2014年3月行根治性手術的胃癌病標本，并從中隨機選取48例。所有腫瘤組織標本均常規固定包埋，HE染色，病理確診為胃癌，且病例術前均未行放療及化療治療。其中男29例，女19例；年齡39～78歲，平均（59.27±0.01）歲；病理類型：高中分化腺癌13例，低分化腺癌27例，黏液腺癌4例，印戒細胞癌4例；根據國際抗癌聯盟（UICC）關于胃癌TNM分期方法[4]進行臨床分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期14例，Ⅲ期21例，Ⅳ期3例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑兔抗人iNOS多克隆抗體、兔抗人eNOS多克隆抗體、兔抗人nNOS多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；鼠抗人ILK單克隆抗體、兔抗人CD34多克隆抗體、免疫組化SABC染色試劑盒、DAB顯色盒（福州邁新生物技術開發有限公司）。

1.2.2 方法用免組化SABC染色觀察iNOS、eNOS、nNOS、ILK、CD34在胃癌中的表達分布情況。每次染色流程均設有對照作為染色質量控制標準。陽性對照用武漢博士德生物工程有限公司和福州邁新生物技術開發有限公司已證實的陽性iNOS、eNOS、nNOS、ILK、CD34切片為對照，以PBS代替一抗作為陰性對照，至少有2名有經驗的病理醫師獨立觀察切片。

1.2.3 結果判定兩名病理醫師采用雙盲法在200倍視野下隨機選取5個視野，記數每個視野中腫瘤上皮細胞的染色情況。以PBS代替一抗作陰性對照，iNOS、eNOS、nNOS、ILK陽性著色位于細胞質中呈彌漫或散在的棕黃色顆粒的細胞記為陽性細胞。根據瘤組織中陽性細胞的有無及數量分為：陰性（-）：未見陽性細胞；弱陽性（+）：陽性細胞＜10%；陽性（++）：陽性細胞10%～30%；強陽性（+++）：陽性細胞＞30%[5]。

MVD計數參照Weidner等[6]報道的方法，選取被CD34染成棕色的腫瘤微血管分布的最高區域，以與背景明顯有別的任何一個棕色染色的內皮細胞或細胞叢作為一個血管，只要結構不連續，分支結構也作為一個血管計數。先在100倍光鏡下尋找腫瘤中血管密度最高的5個區域，然后在400倍鏡下計數MVD，5個區域的均值為該腫瘤的MVD值。計數由2名不知臨床資料的高年資病理醫師完成，結果取兩者的平均值。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SPSS 19.0對數據進行分析，正態分布計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。Spearman相關分析iNOS、eNOS、nNOS、ILK在胃癌中陽性表達的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織NOS、ILK、MVD的測定結果

iNOS、eNOS、nNOS主要在細胞質表達，呈棕褐色顆粒狀（圖1～3，封四）；ILK主要也在細胞質表達，呈棕褐色顆粒狀（圖4，封四），且腫瘤浸潤邊緣部位染色陽性比腫瘤中心部位多見，同一癌組織內癌細胞間表達強度不均一。本組中iNOS、eNOS、nNOS、ILK的陽性表達率依次為72.92%（35/48），81.25%（39/48），83.33%（40/48），37.5%（18/48）。根據腫瘤類型，不同病理類型的iNOS、eNOS、nNOS、ILK陽性表達差異有統計學意義（P＜0.05）；iNOS、ILK在TNMⅢ+Ⅳ期胃癌組織中的陽性表達明顯高于TNMⅠ+Ⅱ期，差異有統計學意義（P＜0.05）；但eNOS、nNOS在TNMⅢ+Ⅳ期與TNMⅠ+Ⅱ期胃癌組織中的陽性表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。MVD用CD34抗原標記，主要表達于血管內皮細胞的細胞膜（圖5，封四）。MVD染色呈棕黃色，分布不均，最密集的染色區域即“熱點”主要位于癌灶邊緣。不同病理類型的MVD值差異有統計學意義（P＜0.05）；不同TNM分期的MVD值差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 胃癌組織中NOS、ILK的表達與MVD的關系

iNOS、ILK在胃癌組織中陽性表達的MVD值均明顯高于陰性表達者，差異有統計學意義（t=6.940、3.613，P＜0.05）；eNOS、nNOS在胃癌組織中陽性表達的MVD值與陰性表達者比較，差異無統計學意義（t=0.440、0.361，P＞0.05）。見表2。

表1 胃癌組織中NOS、ILK、MVD的測定結果[n（%）]

表2 MVD值及NOS、ILK表達與胃癌的關系

2.3 胃癌組織中NOS與ILK表達的關系

不同的iNOS表達的胃癌組織中ILK表達差異有統計學意義（P＜0.05），相關性分析顯示，胃癌組織中iNOS與ILK表達呈正相關(r=0.375，P＜0.05)。胃癌組織中eNOS、nNOS與ILK表達無明顯關系（P＞0.05）。見表3。

3 討論

NOS是NO合成的限速酶，在人和動物的正常組織細胞中存在廣泛,并且在許多惡性腫瘤組織中廣泛表達,其活性變化通過三種亞型，即誘導型（iNOS）、內皮型（eNOS）和神經型（nNOS）直接調節NO生成量及其生物學行為。近年有研究證明[7]，NO主要在介導的腫瘤血管形成過程的各個步驟如新的血管網構建和血管腔的形成中起著重要作用。NO對腫瘤的影響主要是促進局部微血管網的建立和調節局部血供，通過對血管網及血流量的控制起到促進腫瘤生長及其遠處轉移作用。有研究表明NO在腫瘤的發生、發展過程中具有濃度依賴作用。Ziche等[8]認為低濃度的NO能夠有效對抗基因突變，并激活機體防御功能；高濃度的NO則失去對基因突變的控制，轉而刺激基因突變，誘發腫瘤的發生。Saffi等[9]則認為在腫瘤的生長過程中，低濃度的NO在腫瘤細胞信號傳遞途徑中起調節作用,調節細胞增殖,促進腫瘤微血管網建立，從而有利于腫瘤生長,而高濃度的NO則表現為細胞毒性作用,影響腫瘤細胞間的信號轉導，從而抑制腫瘤的生長。雖然對于NO濃度對腫瘤的影響尚有爭論，但可以肯定的是不同濃度下NO對腫瘤的作用不同。

表3 胃癌組織中NOS與ILK表達間的關系（例）

ILK是一種多功能酶，能參與到多種信號傳導通路中，在腫瘤形成的過程中起重要作用。Sa等[10]研究發現將過表達的ILK細胞導入裸鼠體內可導致裸鼠腫瘤發生，提示ILK是個致癌基因。黃漢等[11]證實在口腔腺樣囊腺癌中ILK高表達，也提示ILK的高表達與惡性腫瘤的發生存在相關性。將腫瘤發生歸于細胞生理的6種基本改變：生長信號的自我滿足；生長抑制（抗生長）的失敏感；細胞程序性死亡（凋亡）的破壞；無限制的復制潛能；永生的血管生成能力；組織侵襲和轉移性。ILK參加細胞基礎功能的調控，調節細胞生長，通過對細胞內信號轉導的調控來影響細胞內外基質的相互作用，因此ILK的改變，哪怕是表達和活性的微小改變，也將導致細胞增殖的異常，腫瘤基因的發生以及細胞內外基質的相互作用。

本研究結果顯示：iNOS、eNOS、nNOS、ILK在腫瘤浸潤邊緣部位染色陽性比腫瘤中心部位多見，不同病理類型胃癌組織中的iNOS、eNOS、nNOS、ILK差異有統計學意義（P＜0.05）；MVD最密集的染色區域即“熱點”主要位于癌灶邊緣，不同病理類型胃癌組織中的MVD差異有統計學意義（P＜0.05）。TNMⅢ+Ⅳ期胃癌組織中的的iNOS、ILK陽性表達率及MVD均明顯高于TNMⅠ+Ⅱ期胃癌組織。說明在胃癌的發生發展過程中有大量的微血管產生，且呈浸潤性生長，侵襲性強，越至腫瘤晚期腫瘤惡性程度越高這種癌灶邊緣表達越強烈，轉移能力強，其原因可能是由于腫瘤內微血管的快速形成，以及腫瘤內血管網的廣泛建立，增加了腫瘤細胞進入血液循環的概率，從而增加其遠處轉移的概率與能力。Jenkins等[12]的研究發現iNOS-19細胞形成的瘤體中MVD表達明顯增高，提示有更多的新生血管生成；Gallo等[13]對頭頸發生惡性腫瘤的患者進行MVD值和NOS檢測，發現隨腫瘤惡性程度增高，NOS表達增加，且淋巴結轉移與NOS存在相關性，腫瘤MVD的變化趨勢與NOS的變化趨勢相一致。而eNOS、nNOS在TNMⅢ+Ⅳ期與TNMⅠ+Ⅱ期胃癌組織中的陽性表達率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；iNOS、ILK在胃癌組織中陽性表達的MVD值均明顯高于陰性表達的MVD值；而eNOS、nNOS在胃癌組織中陽性表達的MVD值均與陰性表達的MVD值差異無統計學意義（P＞0.05），其原因可能與其發生機制有關，eNOS及nNOS主要參與機體正常生理功能的調節，而iNOS則在病理條件下被激活，參與機體免疫及腫瘤的發生、發展過程。

本研究顯示：胃癌患者iNOS與ILK的表達水平呈正相關（r=0.375，P＜0.05）；eNOS、nNOS與ILK的表達無明顯相關（P＞0.05），說明ILK在腫瘤的發生發展過程中與iNOS所引起的血管變化存在聯系，可能是ILK信號通道在整合素ανβ3的激活下，AKT在AKT絲氨酸473位點磷酸化的情況下發生激活，從而增強血管內皮生長因子（VEGF）的表達，促進了腫瘤血管通路的形成及微血管網的建立[14]。Pkb/Akt-473絲氨酸，使mTOR/FRAP-2448磷酸化水平增高，激活了Akt/iNOS通路，促進HIF-1α產生，通過iNOS調節NO調節濃度，達到誘導細胞增殖，啟動VEGF的表達，促進了血管生成，從而起到了促血管生成的作用[15]；同時ILK活化后使GSK-3磷酸化失活，GSK-3磷酸化失活后失去了磷酸化AP-1的能力，使得被脫磷酸化的AP-1恢復了與啟動子結合的能力，繼而與血管內皮生長因子受體結合，激活受體轉導通路，進而啟動VEGF的轉錄[16]。

惡性腫瘤的發生與發展是一直以來都是科學研究的熱點，通過對腫瘤細胞因子的研究，可以在分子生物學水平探討腫瘤的形成機制，進一步揭示腫瘤發生、發展的規律，為腫瘤臨床治療提供新的思路、新的方法。

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Expressions and significance of nitric oxide synthase and integrin-linked kinase in gastric cancer tissues

NIU Lei LEI Li
Department of Pathology,Central Hospital of Fuxin City,Liaoning Province,Fuxin 123000,China

ObjectiveTo detect the expressions of nitric oxide synthase(NOS)and integrin-linked kinase(ILK)in gastric cancer tissues,and analyze the relationship of clinicopathologic factors among them.MethodsFrom March 2010 to March 2014,in Central Hospital of Fuxin City,48 gastric cancer tissues samples from radical surgery were selected, and the expressions of iNOS,eNOS,nNOS and ILK of these samples were detected by SABC immunohistochemical stain.The correlation of iNOS,eNOS,nNOS and ILK were statistically analyzed.ResultsThe positive expression rates of iNOS,eNOS,nNOS and ILK in gastric cancer tissues were 72.92%(35/48),81.25%(39/48),83.33%(40/48),37.5% (18/48).The positive expression rates of iNOS,eNOS,nNOS and ILK in differentgastric cancer pathologicaltype had statistically significantdifferences(P＜0.05);The positive expression of iNOS and ILK in TNMⅢ+Ⅳphase were significantly higher than those in TNMⅠ+Ⅱphase(P＜0.05)，but The positive expression of eNOS,nNOS in TNMⅢ+Ⅳphase and TNMⅠ+Ⅱphase were compared,the differences were not statistically significant(P＞0.05).MVD in different gastric cancer pathological type had statistically significantdifference(P＜0.05),MVD in different TNM phase had statistically significantdifference(P＜0.05).MVD of iNOS,ILK positive expression gastric cancer tissues were higher than those of nagtive expression,the differences were statistically significant(P＜0.05),iNOS of gastric cancer tissues had a positive correlation with ILK(r=0.375,P＜0.05).ConclusioniNOS、eNOS、nNOS、ILK continous increasing expressions participate in the development,invasion and metastasis process of gastric cancer.The positive correlation of iNOS and ILK might start signal transduction pathways by expression of VEGF,promote early tumor angiogenesis and formation.

Gastric Cancer;Microvessel density;Integrin-linked kinase;Nitric oxide synthase

R656.6；R735.2

A

1673-7210（2015）08（b）-0083-05

2015-03-20本文編輯：蘇暢）