柱前熒光標記法結合HPLC-FLD 測定石榴中四種三萜酸

袁恩光，李國梁，*，吳宏亮，劉書成，夏 蓮，尤進茂，，索有瑞

1 曲阜師范大學生命有機分析重點實驗室，曲阜 273165;2 中國科學院西北高原生物研究所，西寧 810001;3廣東海洋大學食品科技學院，廣東省水產品加工與安全重點實驗室，水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，湛江 524088

三萜酸總體可以分為羽扁豆烷型、齊墩果烷型、熊果烷型等結構類型(常見的三萜酸結構式見圖1)。通過對三萜酸類化合物的生物活性及毒性研究，發現其具有溶血、抗炎、抗菌、抗病毒、降低膽固醇、殺軟體動物等活性［1］。近期許多研究也表明三萜酸具有抗腫瘤和抗HIV 病毒的活性［2］。目前三萜酸類化合物中齊墩果酸和熊果酸的研究最為廣泛，其在預防癌癥、保肝護肝等方面有特殊的功效，并且還具有強心、降壓、降脂、降糖等方面生理功能［3］。在許多中藥中三萜酸類化合物能表現出特殊的生理活性，例如枇杷葉中的三萜酸具有鎮咳［4］、降血糖［5］、調節免疫力［6］抗抑郁［7］的功能;山楂中的三萜酸具有預防動脈粥樣硬化［8］和降血脂［9］的功能。三萜酸因其結構復雜人工合成困難，目前主要從天然植物中提取獲得，因此尋找富含三萜酸類化合物的植物來源越來越引起人們的廣泛關注和重視。

在天然藥物中，自身具有較大共軛體系的化合物如黃酮類、蒽醌類等可以在紫外檢測器或者熒光檢測器下進行準確的測定。但是三萜酸類分子本身并沒有共軛體系并且紫外吸收也比較低，所以很難采用一般的分光光度法對其含量進行準確的測定。近年來所采用的氣相色譜、HPLC-UV［10］、HPLCMS［11］、毛細管電泳［12］等在選擇性、靈敏性、準確性和效率方面都沒有太大的進步或者存在諸多的缺點和不足。本實驗采用HPLC-FLD-MS 技術，2-(7H-二苯并［a，g］咔唑)乙基對甲苯磺酸酯(DBCETS)作為熒光標記試劑，建立了高靈敏、高選擇性的三萜酸檢測方法，該方法可在45min 內實現4 種三萜酸的基線分離，檢測限(S/N=3)可達1.10～1.48 ng/mL，這種方法與常規方法相比具有快速、高效、靈敏等優點。

石榴是一種具有較高營養價值和保健功能的藥食兩用資源，有“全身是寶”的美稱。目前我國已成為是世界上第一大石榴種植國。從石榴皮中鑒定出來的化合物主要有黃酮類、生物堿類、鞣質類、有機酸類等［13］，石榴中三萜酸成分的報道較少，只有關于齊墩果酸與熊果酸的報道［14］。本實驗將利用新建立的方法首次對石榴不同部位中科羅索酸、山楂酸、齊墩果酸及熊果酸進行分析測定。

圖1 山楂酸(a)、科羅索酸(b)、熊果酸(c)、齊墩果酸(d)的化學結構式Fig.1 Chemical structures of maslinic acid(a)，corosolic acid(b)，ursolic acid(c)and oleanolic acid(d)

1 材料與方法

1.1 實驗藥品

三萜酸標準對照品，包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸均購自Sigma 公司(圣路易斯，密蘇里州，美國);HPLC 級乙腈(CH3CN)購自禹城化學試劑有限公司(山東省，中國);2-(7H-二苯并［a，g］咔唑)乙基對甲苯磺酸酯(DBCETS)為實驗室自制;娃哈哈純凈水、碳酸鉀和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等其它試劑均為分析純。

1.2 儀器設備與條件

Agilent 1100 液相色譜-質譜聯用儀(Agilent 公司，美國)，配備四元梯度泵(G1311A)、在線真空脫氣機(G1322A)、熒光檢測器(G1321A)和自動進樣器(G1316A);質譜系統:Esquire-LC NT software;高效液相系統軟件:HP ChemStation;色譜條件:Hypersil BDS C18柱(200×4.6 mm，5 μm，依利特公司，大連，中國)，流速為1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫25 ℃，熒光激發和發射波長分別為300 nm 和395 nm;流動相為乙腈/水(5∶95，v/v)(A)和乙腈(B);梯度洗脫程序:0～5 min，65%B;5～15min，65%～90%B;15～38 min，90%～92%B;38～40 min，92%～93%B;40～45 min，93%～100%B。所用流動相經過0.2(m 的尼龍膜過濾。質譜條件:大氣壓化學電離源(APCI)，正離子模式，噴霧壓力60 psi，干燥氣流量為5 L/min，干燥氣溫度350 ℃，Vap 溫度450 ℃，毛細管電壓3500 V，電暈電流4000 μA(Pos)。KQ-100DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.3 石榴樣品

石榴(Punica granatum)采自中國山東棗莊地區，將石榴樣品的果皮、石榴花、石榴籽各部分分開，在50 ℃條件下干燥至恒重，用不銹鋼碾碎器碾成粉末后過篩(60 目)，儲存在冰箱中備用。稱取10 g粉末樣品，于三頸燒瓶中加入100 mL 90%乙醇，超聲萃取10 min，取部分提取液進行抽濾，取所得濾液2 mL 氮氣吹干，殘余物用200 μL 乙腈重新溶解備用。

1.4 標準溶液的配制

準確稱取23.25 mg DBCETS 用DMF 定容至10 mL，相應低濃度的溶液用DMF 稀釋而成。稱取三萜酸標品，用乙腈/DMF(9∶1，v/v)配制成濃度為1×10-2mol/L 標液，相應低濃度的三萜酸標品用乙腈/DMF(9∶1，v/v)稀釋而成，放置于冰箱中于4 ℃下保存。

1.5 熒光標記條件優化

響應面法在較少的時間次數和較短的時間內對所進行的實驗進行全面研究與分析。在熒光標記條件優化實驗中選取標記時間(min)、標記溫度(°C)及標記試劑用量進行組合。以-1、0、1 代表自變量水平，按方程xi=(Xi-X0)∕ΔX 對自變量進行編碼。其中，xi為自變量的編碼值;Xi為自變量的真實值;X0為實驗中心點處自變量的真實值;ΔX 為自變量的變化步長。實驗因素見表1。

采用Design Expert(Trial Version 7.0.3，Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA)軟件對實驗數據進行回歸分析，擬合二次多項式方程可以表達為:

式中:Y 為預測響應值(衍生化效率);Xi和Xj為自變量編碼水平;β0為常數項;βi為線性回歸系數;βii為二次項回歸系數;βij為交互項回歸系數。多項式模型方程擬合可靠性由R2表達，其統計學上的顯著性由F 值檢驗。

1.6 三萜酸熒光標記

向2 mL 安瓿瓶中依次加入200 μL 衍生試劑，30 μL 三萜酸混合標品或樣品提取溶液(100 μL)，10 mg K2CO3和125 μL DMF，密封后于90 ℃水浴中振蕩反應30 min，完畢后放置冷卻，向衍生液中加入500 μL 乙腈/DMF(1∶1，v/v)稀釋后直接進樣10 μL。三萜酸的熒光標記概況圖見圖2。

圖2 三萜酸熒光標記示意圖Fig.2 The derivatization of DBCETS with betulinic acid

2 結果與討論

2.1 三萜酸標記條件優化

本研究采用三因素三水平BBD 設計優化標記試劑用量、標記時間及標記溫度，實驗結果列于表1中。方差分析表明，模型具有較高的顯著性(P＜0.001)，溫度對衍生反應影響不顯著。R2＞0.96 表明，實驗數據與模型預測值相吻合。失擬項的F 值不顯著，意味著模型對于預測反應精確性很高。變異系數(C.V.%)小于9.76%表示該模型具有很好重復性。通過對實驗數據進行回歸擬合，得多元二次回歸模型:

通過響應面圖可直觀地反映各因素的交互作用對響應值的影響，從而確定最佳衍生條件。圖3a 為標記試劑用量與標記時間對標記效率的影響，如圖所示隨著衍生試劑量的增加，衍生效率增加，當標記試劑量達到一定值時，隨著標記試劑量的增加衍生效率略有降低;標記時間從25 min 提高到35 min 過程中，隨著時間的延長，標記效率先升高到最大值，然后趨于穩定。另外圖3b 為標記時間與標記溫度對衍生化效率的影響;圖3c 為標記溫度與標記試劑用量對標記效率的影響。通過軟件Design-Expert求解回歸方程，得到三萜酸熒光標記的最佳標記條件:標記試劑與三萜酸摩爾比為7，標記溫度為90 °C，標記時間為30 min，模型預測值為1325，在此條件下進行3 次平行實驗，測定得峰面積為1390，與預測值基本吻合，偏差較小，證明該模型用于優化三萜酸的標記條件是可行的。

表1 響應面實驗因素與水平、實驗設計及結果(峰面積)Table 1 Factors，levels and response values(peak area)of response surface analysis

注:X1:時間;X2:溫度;X3:試劑與標準品摩爾比。Note:X1:labeling time;X2:reaction temperature;X3:molar ratio of labeling reagent to standard.

圖3 因素交互作用對三萜酸標記效率影響的響應面圖Fig.3 The 3D response surface plots of peak area affected by labeling conditions

2.2 色譜分離與質譜鑒定

本研究對不同色譜柱包括Hypersil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil BDS C8(200 mm×4.6 mm，5 μm)、Hypersil BDS C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)、Spherisorb C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)進行了評估，結果表明Hypersil BDS C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)分離效果最好。同時我們還對不同的流動相進行了考察，結果表明最佳流動相為A:乙腈/水(5∶95，v/v)，流動相B:100%乙腈。混合標準品的色譜圖見圖4。實驗中通過標準對照品保留時間及在線質譜對各色譜峰進行定性。三萜酸衍生物產給出強烈的分子離子峰，分子離子碰撞誘導解離后產生多個特征碎片離子峰。代表性的熊果酸衍生物的質譜數據見圖5，如圖所示熊果酸衍生物在質譜條件下產生分子離子峰m/z 747.8(MS)，特征碎片峰m/z 294.4、m/z 409.3 和m/z 730(MS/MS)。

2.3 線性回歸方程、檢出限重現性和回收實驗

圖4 混合標準品色譜圖:過量熒光標記試劑(a)、山楂酸(b)、科羅索酸(c)、齊墩果酸(d)、熊果酸(e)Fig.4 HPLC-FLD chromatogram of the mixed standard:excessive fluorescent labeling reagent(a)，maslinic acid(b)，corosolic acid(c)，oleanolic acid(d)and ursolic acid(e)

本實驗采用建立的色譜方法，進樣量在0.025～6.0 μg/mL 范圍內，依據峰面積和進樣量，對所測定的三萜酸類化合物進行線性回歸，所得各衍生物的回歸方程、相關系數和檢出限(信噪比按S/N=3計算)見表2。方法的檢測限為1.10～1.48 ng/mL。對三萜酸衍生物平行六次分析，保留時間和峰面積的相對標準偏差在0.01%～0.05% 和1.28%～1.85%范圍內。

圖5 熊果酸衍生物的質譜裂解模式圖Fig.5 MS and MS/MS spectra of representative ursolic acid derivative and the cleavage mode of protonated molecular ion

為了評估實驗的準確性，稱取一定量的石榴樣品，精確加入一定量的三萜酸對照品進行提取分析，并計算回收率。回收率根據公式(測量值-內源性值)/添加值×100% 計算，結果見表2，三萜酸的回收率在92.9%～100.4%之間。

表2 線性方程、檢測限、精密度和準確度Table 2 Linear equations，detection limits，precision and accuracy of the developed HPLC-FLD method

2.4 新建立的方法與已報道方法對比

將建立的新方法與已報道的三萜酸測定方法進行比較，對比結果見表3。在大多數情況下，三萜酸利用HPLC 結合各種檢測器直接測定，沒有采用衍生化的方法。但是三萜酸沒有生色基團，最常用的檢測波長是205 nm 附近，這會導致檢測限偏高和基線波動，不能實現三萜酸的準確定量分析。HPLC結合蒸發光散射檢測器(ELSD)，質譜(MS)和核磁共振(NMR)也有報道，得到的檢測限在pmol/μL 水平(見表3)。本方法給出的檢測限為1.10～1.48 ng/mL，明顯低于表3 中已報道的方法(HPLC-MS、GC、CE 等)，表明該方法比已報道的方法具有更高的檢測靈敏度。此外HPLC-MS 儀器設備昂貴，且普及率低，而HPLC-FLD 設備價格相對便宜，一般常規實驗室均有配備。

表3 新建立的方法與已報道方法對比Table 3 Comparison of the developed method with traditional methods

2.5 石榴樣品中三萜酸分析

我們將新建立的方法應用于石榴中不同部位(包括果石榴皮、石榴花、石榴籽)的三萜酸分析。石榴中的不同部位色譜圖見圖6。其中有四種三萜酸被檢測到，包括山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸。四種三萜酸的含量見表4。石榴中不同部位三萜酸含量有差異。例如:石榴花中的齊墩果酸和熊果酸含量明顯比山楂酸和科羅索酸高，而石榴皮和石榴籽中的四種三萜酸的含量差距相對比較小。石榴花中的齊墩果酸和熊果酸含量很高可達201.5 mg/g 和206.3 mg/g。石榴籽中的科羅索酸含量最高。石榴皮中的四種三萜酸含量相對都較少。

圖6 石榴花(A)、石榴皮(B)及石榴籽(C)的HPLC-FLD 色譜圖Fig.6 HPLC-FLD chromatograms of pomegranate flower(A)，pomegranate rind(B)and pomegranate seeds(C)

表4 石榴中不同部位四種三萜酸的含量Table 4 Triterpenic acid content in different parts of pomegranate

3 結論

本實驗首次采用DBCETS 作為熒光標記試劑，結合HPLC-FLD-MS 技術，建立了快速、高靈敏的三萜酸檢測方法。對石榴中三萜酸柱前熒光標記條件進行了系統研究，從而保證了三萜酸的充分提取及熒光標記。該分析方法可在45 min 內實現4 種三萜酸的基線分離，檢測限(S/n=3)可達1.10～1.48 ng/mL，與已報道方法相比具有檢測靈敏度高、選擇性強、分析時間短等優勢。將建立的方法對石榴中的不同部位包括石榴皮、石榴花、石榴籽中的三萜酸組分進行了準確定量分析。該研究為三萜酸的檢測方法研究提供了新思路，建立的方法可廣泛應用于其它植物樣品中三萜酸快速、高靈敏檢測分析。同時該研究得到的石榴中不同部位的三萜酸含量信息，為石榴資源的綜合利用及深層次產品開發提供數據支持。

1 Yao XS(姚新生)，Wu LJ(吳立軍).Medicinal chemistry of natural products，The Fourth Edition(天然藥物化學第四版).Beijing:People’s Medical Publishing House，2003.306.

2 Janakiram NB，Indranie C，Malisetty SV，et al.Chemoprevention of colon carcinogenesis by oleanolic acid and its analog in male f 344 rats and modulation of cox-2 and apoptosis in human colon HT-29 cancer cells.Pharm Res-Dordr，2008，25:2151-2157.

3 Somova LO，Nadar A，Rammanan P，et al.Cardiovascular，antihyperlipidemic and antioxidant effects of oleanolic and ursolic acids in experimental hypertension.Phytomedicine，2003，10:115-121.

4 Liu RX(劉榮霞)，Bi KX(畢開順).Establishment of HPLC-fingerprint analysis for the quality assessment of Angelica sinensis.Chin Pharm J(中國藥學雜志)，2003，38:757-760.

5 Li F(李鋒)，Wang H(王航)，Xue YK(薛原楷)，et al.The experimental study on hypoglycemic activity of triterpenic acids from loquat leaf.Pharm Biotechnol(藥物生物技術)，2011，18:328-331.

6 Ge JF(葛金芳)，Hu CM(胡成穆)，Li J(李俊)，et al.Immunoregulatory actions of triterpene acids loquat leaf(TAL).Chin Pharmacol Bull(中國藥理學通報)，2006，22:1194-1198.

7 Cao WW(曹尉尉)，Lu B(陸波).Antidepressant activity of centalla asiatic triterpenic acid and its main constituents.J Pharm Prac(藥學實踐雜志)，2008，26:185-187.

8 Zhu YF(褚衍芳)，Hang WX(黃文興).Effect of sheng mai injection on glucocorticoid receptor content in peripheral leukocytes in rats.Pharmacol Clin Chin Mater Med(中藥藥理與臨床)，1988，4(2):22-27.

9 Mou YD(繆亞東)，Ouyang Z(歐陽臻)，Yuan B(袁斌).Study on purification of the effective position of the droping blood-fat from fructus crataegi.Food Res Dev(食品研究與開發)，2008，29:104-108.

10 Kontogianni VG，Exarchou V，Troganis A，et al.Rapid andnovel discrimination and quantification of oleanolic and ursolic acids in complex plant extracts using two-dimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy--comparison with hplc methods.Anal Chim Acta，2009，635:188-195.

11 Fang X，Wang J，Yu X，et al.Optimization of microwave-assisted extraction followed by rp-hplc for the simultaneous determination of oleanolic acid and ursolic acid in the fruits of chaenomeles sinensis.J Sep Sci，2010，33:1147-1155.

12 Yang P，Li Y，Liu X，et al.Determination of free isomeric oleanolic acid and ursolic acid in pterocephalus hookeri by capillary zone electrophoresis.J Pharm Biomed，2007，43:1331-1334.

13 Tang LL(唐麗麗)，Liu LW(劉鄰渭)，Sun LF(孫麗芳)，et al.Pomegranate peel polyphenols extraction and analysis.Food Res Dev(食品研究與開發)，2010，31:121-126.

14 Zheng YM(鄭藝梅)，Liu CH(劉長華)，Chen SK(陳樹坤).Study on the ingredient difference between granatum and pomegranate seed.Acade Period Farm Prod Proc(農產品加工·學刊)，2008，12:37-49.

15 Lee MK，Ahn YM，Lee KR，et al.Development of a validated liquid chromatographic method for the quality control of prunellae spica:Determination of triterpenic acids.Anal Chim Acta，2009，633:271-277.

16 Guo S，Duan JA，Tang YP，et al.Characterization of triterpenic acids in fruits of ziziphus species by HPLC-ELSD-MS.J Agric Food Chem，2010，58:6285-6289.

17 Sánchez ávila N，Priego Capote F，Luque de Castro MD.Ultrasound-assisted extraction and silylation prior to gas chromatography-mass spectrometry for the characterization of the triterpenic fraction in olive leaves.J Chromatogr A，2007，1165:158-165.

18 Qi S，Ding L，Tian K，et al.Novel and simple nonaqueous capillary electrophoresis separation and determination bioactive triterpenes in chinese herbs.J Pharm Biomed Anal，2006，40:35-41.