楓楊樹皮抗菌物質的分離鑒定研究

羅 彭，王佳佳，李 兵，郭占京，廖彭瑩，陳 俊，李漢浠，潘為高

廣西中醫藥大學，南寧 530001

楓楊(Pterocarya stenoptera C.DC.)為胡桃科楓楊屬植物［1］，原產我國，地域分布廣泛、枝條扦插即活，生長繁殖迅速，屬于極易可再生資源。楓楊在抗腫瘤、抗病毒、殺滅釘螺等方面有一定的藥用價值;但其更為重要的價值，是在民間作為傳統外用中藥用于治療各類真菌性皮膚病和細菌性膿、瘡［2］，此用藥習慣在古籍、古方及當代中藥書籍中均有大量記載，用法是將其樹皮、樹葉搗碎用于治療疥癬、腳癬、頭癬［3］和其它病菌性疾病［4］。楓楊抗菌用藥歷史悠久，療效肯定，用藥安全性也得到了時間的驗證。

楓楊的抗菌物質基礎研究，目前才剛剛起步。張興悅［5］等證實楓楊乙醇或丙酮提取物有抑菌作用，但并未開展活性單體層面的研究。筆者前期研究從楓楊樹皮分離純化得到了一個抗菌單體5-羥基-2-乙氧基-1，4-萘醌［13］，但研究并不系統。本研究前期發現楓楊中還有許多尚待分離的潛在抗菌成分。本研究通過生物活性跟蹤法與現代分離純化技術結合，系統地開展楓楊的抗菌活性物質的追蹤研究，盡可能全面探明其抗菌作用的物質基礎，尋找新的抗菌素，同時為研制抗菌活性部位藥及控制藥材質量奠定基礎。

1 材料與儀器

1.1 藥材

藥材采集于廣西桂林興安縣五里峽壩區，經廣西中醫藥大學韋松基教授鑒定為胡桃科楓楊屬植物楓楊(Pterocarya stenoptera C.DC.)的樹皮。藥材陰干、粉碎，于4 ℃密閉保存。

1.2 試劑

石油醚(30～60 ℃、60～90 ℃兩種沸程規格)、氯仿(AR)、二氯甲烷(AR)、乙酸乙酯(AR)、無水乙醇(AR)、丙酮(AR)均由西隴化工股份有限公司生產;柱層析硅膠(100～200、200～300 目)和薄層層析硅膠H(60 型)購于青島海洋化工集團公司;10 cm×20 cm 硅膠G 板為武安市誠朋科技開發有限公司產品;Sephadex LH-20 葡聚糖為瑞士安瑪西亞產品。

1.3 菌種

卡拉雙球菌(Dipococcus cata)、大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙 門 氏 菌(Salmonella sp.)、白 色 念 球 菌(canidia Albicans)、棉花球菌(Cotton cocci)、鞭毛菌(Mastigomycotina)、放線菌(Actinomycete)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、姜瘟菌(Pseudomonas solanacearum)、小麥赤霉(Fusarium graminerum)、玉米大斑菌(Exserohilum-trucicum)、墨入菌(Phoma wasabiae)等菌種由四川大學生命科學學院微生物研究室提供。

1.4 儀器與設備

HD-650 超凈臺(吳江市偉峰凈化設備有限公司);DZF-2001 真空干燥箱(上海浦東躍欣科學儀器廠);RE-52AA 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);100～1000 μL 量程及10～100 μL 量程移液槍(Eppendorf);Mettler-AE100 電子分析天平(瑞士Mettler公司);Bruker Avance-600 型和Bruker AM-400 型核磁共振波譜儀(瑞士布魯克公司);Agilent 6890/5973N 型GC-MS 聯用儀(美國安捷倫公司)。

2 實驗方法

2.1 抗菌活性的測定方法

2.1.1 肉湯瓊脂培養基的配制

蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉浸膏3 g，瓊脂20 g，水1000 mL，加熱溶化后濾過，用pH 計調pH 值至7.4～7.6，0.15 Mpa 滅菌20 min，待用(細菌、真菌在此培養基上均能良好生長)。

2.1.2 藥物配制

用于實驗的各化合物(藥物)均進行干燥，徹底除去溶劑。藥物用滅菌注射用水配制，用少量無菌DMSO 助溶，均配成統一濃度10 g/L(1.0%)。

2.1.3 瓊脂平板打孔法測定抗菌活性(一菌多藥，定性測定)

在無菌平皿內加入熔化的肉湯瓊脂培養基，凝固后作為底層(厚約0.5 cm);再取50 ℃熔化的肉湯瓊脂培養基，鋪在底層之上，凝固后作為上層(厚約0.5 cm)。用推平板接種法，將供試驗菌液均勻地涂布于瓊脂平板的表面，用無菌打孔器打孔，孔徑0.5 cm，只打穿上層瓊脂，孔距2 cm，均勻分布。用移液器分別吸取各藥液約90 μL 加于各瓊脂孔內。于37 ℃培養18～24 h，觀察孔周圍有無抑菌圈，通過抑菌圈的大小比較各藥物的抗菌效力。

2.2 抗菌活性成分的分離純化

楓楊樹皮粗粉3.0 kg，用約30 倍量90%乙醇滲漉提取，濾液負壓濃縮回收溶劑，敞口水浴揮發得乙醇干膏約300.0 g。藥材殘渣，再用20 倍量水滲漉提取，濾液濃縮干燥后得水提取干膏約233.0 g。

進行抗菌測定，發現水提取物對各菌無明顯抑制作用，90%乙醇提取物對卡拉雙球菌、白色念球菌、棉花球菌、鞭毛菌、放線菌、大腸桿菌、姜瘟菌、金黃色葡萄球菌、玉米彎孢菌、玉米大斑菌、墨入菌均具有不同程度的抑制作用，其中對卡拉雙球菌、小麥亦霉的抑制作用最強。故而后續抗菌活性成分的分離純化起始部位采用90%乙醇提取物，選用抗菌效果最為顯著的卡拉雙球菌(細菌)、小麥赤霉(真菌)作為篩選活性成分的實驗用菌。

300 g 乙醇提取物用適量熱水懸浮，用60～90℃沸程石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得石油醚部位51 g、氯仿部位42 g、乙酸乙酯部位44 g、正丁醇部位77 g、水層部位86 g，經抗菌實驗發現，氯仿部位有很強的抗菌作用，石油醚部位、乙酸乙酯部位抗菌作用較弱，正丁醇部位和水層部位無抗菌作用。

40 g 氯仿部位用甲醇熱溶，適量硅膠分散制樣并干燥。1000 g 硅膠(100～200 目，柱內徑10 cm)濕法裝柱，上樣，用氯仿:甲醇梯度洗脫(80∶1→40∶1→20∶1→10∶1→5∶1→甲醇)，得6 個梯度流份。經體外抗菌指標檢測，40∶1、10∶1、5∶1 流份段有高活性，其余流份段無活性。

將上述40∶1 流份段(量較大)上硅膠中柱(200～300 目，柱內徑5 cm，高20 cm)，用石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫(20∶1→10∶1→甲醇)，得到3 個梯度流份，經體外抗菌指標檢測，其中10∶1、甲醇流份段為高活性段，20∶1 流份段為低活性段。將10∶1 流份段上硅膠小柱(薄層硅膠H，柱內徑2 cm，高30 cm，N2加壓)，經石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫(10∶1→甲醇)，得紅色針狀結晶1(24 mg)、2(20 mg)和甲醇段，經體外抗菌指標檢測，結晶1、2 均有明顯的抑菌效果，而甲醇段無活性。

將上述40∶1 中得到的高活性甲醇流份段直接上硅膠小柱，經石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脫(4∶1→2∶1→乙酸乙酯)，在2∶1 梯度洗脫時分離得到黃色針狀結晶3(10 mg)，經抗菌指標檢測，結晶3 有明顯的抑菌效果，其余流份段無活性。

將乙酸乙酯部位(28 g)上硅膠大柱，用二氯甲烷∶甲醇梯度洗脫，在5∶1 梯度得到淺黃色針狀結晶4，經體外抗菌指標檢測，有明顯的抑菌效果。

對抗菌活性結晶1、2、3、4 分別用Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠色譜柱進行除雜，二氯甲烷∶甲醇(1∶1)洗脫，得到各高純度單體，經TLC 薄層確定純度，用于結構研究。

2.3 抗菌活性物質的結構鑒定

EI-MS 在Agilent 6890/5973N 型GC-MS 聯用儀上進行，電離方式EI+，電子能量70 eV，掃描范圍50～1000 Da。

1D NMR(1H、13C、DEPT)和2D NMR(HSQC、1H-1H COSY、HMBC)在Bruker Avance-600 型和Bruker AM-400 型核磁共振波譜儀上進行。1H 頻率為600(或400 MHz)，13C 頻率為125(或100)MHz，溶劑為CDCl3或CD3OD，TMS 為內標，常溫20 ℃測定。

3 實驗結果

化合物1 紅色針狀結晶，易溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇，不溶于水。三種不同的展開劑系統進行硅膠TCL 檢測，氨顯，均為粉紅色單斑［石油醚∶乙酸乙酯(8∶1)，Rf=0.40;石油醚∶丙酮(6∶1)，Rf=0.0.48;氯仿∶甲醇(60∶1)，Rf=0.83］，純度符合波譜測定要求。EI-MS m/z∶174［M］+(基峰)，146，118，92，63.綜合分析化合物1 的1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、1H-1H COSY 和HMBC 數據(表1)，并參照文獻［6］，確定該化合物為5-羥基-1，4-萘醌(C10H6O3，M=174，胡桃醌，圖1)。

化合物2 紅色針狀結晶，易溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿、甲醇，不溶于水。三種不同的展開劑系統進行硅膠TCL 檢測，氨顯，均為粉紅色單斑［石油醚∶乙酸乙酯(2∶1)，Rf=0.65;石油醚∶丙酮(4∶1)，Rf=0.43;氯仿∶甲醇(80∶1)，Rf=0.62］，純度符合波譜測定要求。EI-MS m/z∶204［M］+(基峰)，174，147，105，63.綜合分析化合物2 的1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、1H-1H COSY 和HMBC 數據(表1)，并參照文獻［7］，確定該化合物為5-羥基-2-甲氧基-1，4-萘醌(C11H8O4，M=204，圖1)。

化合物3 黃色針狀結晶，易溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿，不溶于甲醇、水。三種不同的展開劑系統進行硅膠TCL 檢測，紫外下均顯暗紫色單斑［石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)，Rf=0.42;石油醚∶丙酮(2∶1)，Rf=0.43;氯仿∶甲醇(30∶1)，Rf=0.75］，純度符合波譜測定要求。EI-MS m/z∶168［M］+，153，127，97，69(基峰)，50。綜合分析化合物3 的1H NMR、13C NMR、DEPT、HSQC、1H-1H COSY 和HMBC 數據(表1)，并參照文獻［8］，確定該化合物為2，6-二甲氧基-1，4-對苯醌(C8H8O4，M=168，圖1)。

化合物4 淺黃色針狀結晶，溶于甲醇，不溶于氯仿。三種不同的展開劑系統進行硅膠TCL 檢測，硫酸-乙醇顯色及碘顯色，均為棕黃色單斑［環己烷∶乙酸乙酯(6∶1)，Rf=0.74;石油醚∶乙酸乙酯∶冰醋酸(40∶10∶1)，Rf=0.70;氯仿∶甲醇∶冰醋酸(9∶4∶1)，Rf=0.54］，純度符合波譜測定要求。EI-MS m/z:170［M］+(基峰)，153，152，125，77;1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ:7.06(2H，s，H-2，6);13C NMR和DEPT(100 MHz，CD3OD)δ:170.5(C-7，C)，146.4(C-3，5，C)，139.6(C-4，C)，121.9(C-1，C)，110.3(C-2，6，CH)。核磁數據與文獻報道［9］的沒食子酸的數據一致，因此化合物4 鑒定為3，4，5，-三羥基苯甲酸(C7H6O5，M=170，圖1)。

表1 化合物1、2、3 的一維和二維核磁譜數據(600/150 MHz to TMS，CDCl3)Table 1 1D-and 2D NMR spectral data of compounds 1，2 and 3(in CDCl3at 600/150 MHz to TMS)

圖1 化合物1、2、3 和4 的結構式Fig.1 Structure of compound 1，2，3 and 4

4 討論

本研究通過生物活性跟蹤法結合現代分離純化技術，發現楓楊乙醇提取物及其氯仿萃取部位有明顯抑菌作用，而石油醚或乙酸乙酯部位抑菌作用較弱，正丁醇或水部位無抗菌作用;首次從氯仿部位和乙酸乙酯部位篩選出4 個高活性抗菌單體，分別為5-羥基-1，4-萘醌(1)、5-羥基-2-甲氧基-1，4-萘 醌(2)、2，6-二甲氧基-1，4-對苯醌(3)、沒食子酸(4)。本研究采用化學結合生物活性追蹤法得到的抗菌活性單體，與一般的化學方法分離得到的化學成分的方式有所區別，同時所有活性成分均為首次從楓楊中獲得。

5-羥基-1，4-萘醌(1)又名胡桃醌，抗菌譜廣，抗菌效價高，主要在對數期，通過破壞菌體的細胞壁或細胞膜結構抑制細菌生長［10］。2，6-二甲氧基-1，4-對苯醌(3)抗菌譜廣，在很低濃度下即可殺滅多種致病性細菌、真菌［11］。沒食子酸(4)對6 種常見食源性致病菌和腐敗菌的最小抑菌濃度為0.125～4.000 mg/mL，主要抑制菌體在對數生長期的分裂［12］。除了本研究所篩選到的4 個高活性抗菌單體，筆者先前已從楓楊樹皮篩選鑒定出另一個高活性抗菌單體5-羥基-2-乙氧基-1，4-萘醌［13］，經抗菌測定，發現該物質抗菌譜較廣，對多種細菌、真菌有顯著拮抗作用，抗菌活性強度近似于左氧氟沙星［14］。該物質與5-羥基-2-甲氧基-1，4-萘醌(2)在結構上只是取代基(乙氧基、甲氧基)的差異。

可見楓楊抗菌成分類別或化學結構母核豐富，其抗菌物質基礎由一系列(目前發現5 個)的抗菌活性物質組成，它們的碳骨架分別屬于苯醌(1 個)、萘醌(3 個)、苯甲酰(1 個)三類化學母核。

楓楊樹皮外用抗菌用藥歷史悠久，療效肯定;楓楊植物地域分布廣，極易再生，資源優勢明顯。本研究及前期研究發現楓楊集3 類抗菌結構母核、5 個抗菌成分于一身，是一味難得的抗菌中藥;多類別的抗菌單體，可能從多機理途徑、多靶位點發揮抗菌療效，為開發出不易產生耐藥性的外用抗菌部位藥提供理論基礎。本研究揭示的多抗菌母核組成的楓楊抗菌物質基礎，也為楓楊藥材的質量標準制定奠定了基礎。

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