不同劑量野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓模型的實驗研究

董麗君，陳 鵬，程江濤

不同劑量野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓模型的實驗研究

董麗君，陳 鵬，程江濤

目的 觀察不同劑量的野百合堿誘導大鼠肺動脈高壓模型的建立，探索合適的野百合堿造模劑量。方法 將60只雄性SD大鼠隨機分成4組，正常對照組、野百合堿低劑量組、野百合堿中劑量組和野百合堿高劑量組，一次性給予頸背部皮下注射不同劑量野百合堿誘導建立肺動脈高壓大鼠模型。4周后，測量各組大鼠肺動脈壓力、心輸出量、肺血管阻力以及右心室肥厚程度。 結果 野百合堿高劑量組大鼠死亡率、肺動脈壓力、右心室室壁厚度高于中劑量組、低劑量組和正常對照組(P<0.001)，心輸出量低于中劑量組、低劑量組和正常對照組(P<0.001)；高劑量組肺動脈壓力、肺血管阻力高于中劑量組、低劑量組(P<0.001)。 結論 中劑量組野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓模型更為接近大鼠肺動脈模型的理想數值。

肺動脈高壓；野百合堿；心輸出量；肺血管阻力；右心室肥厚

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)主要引起肺動脈壓力升高、肺血管阻力增加，其形態學特征是肺動脈血管結構重建和右心室肥大。肺動脈高壓一般分為原發性和繼發性，原發性少見，而繼發性肺動脈高壓常見于由于各種慢性阻塞性肺疾病導致的缺氧或高原低氧環境，又被稱為低氧性，這是肺心病發生的核心環節；繼發性肺動脈高壓還見于先天性心臟病大量血液分流，嚴重者最終成為器質性梗阻性肺動脈高壓，從而喪失外科手術的機會，預后不良，病死率居高不下[1，2]。 因此，對于肺動脈高壓的進一步研究顯得尤為緊迫，而肺動脈高壓模型的建立就顯得尤為重要。目前文獻中在眾多肺動脈高壓模型的建立中，最常用的為野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓模型，野百合堿為一種雙吡咯類生物堿，經血液循環后到達肺臟從而引起慢性血管炎性病變，接近臨床發病機制[3，4]。劑量通常為40 mg/kg、50 mg/kg和60 mg/kg，但對于哪一種劑量最為合適仍眾說紛紜。同時了解模型大鼠的血流動力學狀態是其他相關研究的基礎，其中肺動脈壓力、心輸出量和肺血管阻力都是檢測的相關重要指標，也是評判模型是否成功的關鍵。文獻報道多采用改良后PE-50導管直接插入檢測大鼠的肺動脈來檢測肺動脈壓力，采用熱稀釋法測量大鼠心輸出量，同時進一步計算出肺動脈阻力，從而更為準確反映出模型大鼠的心功能狀態[5]。本研究旨在通過實驗找出最為適合的、病死率較低的、可靠的野百合堿造模劑量。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物及儀器 Monocrotaline(購于美國Sigma公司)以無水乙醇和生理鹽水2∶8制備成1%的溶液，混勻，備用。水合氯醛(上海拓然生物有限公司)以生理鹽水溶解(6%)。肝素溶于生理鹽水配置濃度為25 U/mL。PE-50聚氯乙烯導管，生物探測儀機器配套的壓力換能器、溫度探測器和配套心排量導絲(MLT1402 T-type Ultra Fast Thermocouple Probe)購于上海Adinstrument儀器國際貿易公司。

1.2 實驗動物及分組 雄性SD大鼠60只，體重180 g～220 g，購于上海第二軍醫大學。隨機分為4組，每組為15只。正常對照組腹腔注射乙醇生理鹽水2∶8的溶液，低劑量組頸背部一次性皮下注射野百合堿為40 mg/kg，中劑量組為50 mg/kg，高劑量組為60 mg/kg，同等環境下飼養28 d。

1.3 大鼠一般情況觀察 包括生長情況，飲食，毛發，呼吸，活動，鼻腔、口腔和眼睛出血情況，有無感染及死亡情況。

1.4 肺動脈壓力和心輸出量測定 大鼠飼養28 d后，大鼠肺動脈壓力測定采用改良后的PE-50導管末端呈半圓弧型所行右心導管術測定；心輸出量采用熱稀釋法測定，肺血管阻力由肺動脈壓力和心輸出量間接計算得出。大鼠稱重，6%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰臥位固定后，備皮消毒，沿正中切開氣管插管后，用改良后的PE-50導管連通生物探測儀及壓力換能器經右側頸靜脈插入肺動脈后測得肺動脈壓力波形及肺動脈壓力，記錄并保存。獲得大鼠的肺動脈壓力后在左側找到頸動脈，將溫度探測儀連接心排量導絲沿頸動脈插入4 cm～6 cm至胸主動脈，然后沿右側上腔靜脈迅速注入(2 s～4 s)0 ℃～4 ℃生理鹽水0.2 mL～0.4 mL，觀察記錄儀上的溫度曲線變化，作好記錄并保存。

1.5 右心室肥厚指數測定 測量完畢，處死大鼠，完整取出大鼠心臟，切去心房，分離右心室(RV)及左心室和室間隔(LV+S)，用濾紙吸干水分后稱重、計算RV/(LV+S)值。

2 結 果

2.1 一般情況 模型組大鼠在皮下注射野百合堿1周之后開始出現動物活動量減少，毛發直豎，灰暗而且無光澤，呼吸明顯急促加快，食欲下降，消瘦。高劑量組在注射2周后死亡3只，4周后共死亡8只，中劑量組在注射2周后死亡1只，4周后死亡共2只，低劑量組及正常組未見死亡。死亡大鼠解剖后出現明顯肺淤血，肺表面不平整，彈性差，肺臟變大。4周之后實驗組大鼠已明顯出現消瘦、呼吸困難、口腔及鼻腔出血、腹水形成，伴隨有肝臟腫大、心臟腫大、右心室室壁增厚等一系列心力衰竭表現。

2.2 實驗動物數量統計 高劑量組在注射2周后死亡3只，4周后共死亡8只，中劑量組在注射2周后死亡1只，4周后死亡共2只，低劑量組及正常組未見死亡。最終共有50只大鼠符合結果分析(見表1)。最終檢測成功率分別為100%、98%和96%(見表2)。

表1 各組大鼠最終存活數量統計 只

表2 各組存活大鼠血流動力學檢測最終成功率 %

2.3 各組大鼠肺動脈壓力 低、中和高劑量野百合堿大鼠的平均肺動脈壓力均顯著高于正常對照組(P<0.001)，并且高劑量組肺動脈壓力明顯高于中、低劑量組。詳見圖1、表3。

2.4 各組大鼠的心輸出量結果 低、中和高劑量野百合堿大鼠的心輸出量明顯低于正常對照組(P<0.001)。詳見表3。

2.5 各組肺血管阻力結果 低、中和高劑量野百合堿組大鼠肺血管阻力明顯高于正常對照組，且高劑量組明顯高于中低劑量組(P<0.001)。詳見表3。

2.6 各組大鼠右心室室壁厚度 與正常對照組相比，低、中、高劑量野百合堿組大鼠右心室不同程度增厚(P<0.001)。詳見表3。

正常對照組 低劑量組

中劑量組 高劑量組

圖1 各組大鼠肺動脈壓力

表3 各組大鼠肺動脈壓力、心輸出量、肺血管阻力、右心室室壁厚度比較(±s)

3 討 論

目前，肺動脈高壓動物模型創建有很多種方法，包括野百合堿模型、慢性低氧模型、野百合堿聯合單側肺切除模型、慢性低氧聯合血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑SU5416以及現在發展迅速的基因工程造模方法[6-10]。但是眾多方法中最為常用的仍然為野百合堿和低氧誘導模型。這兩種方法具有廣泛性、簡潔性，并且在過去很長的一段時間內為各種有關肺動脈高壓的研究做出了巨大貢獻。 注射野百合堿后大鼠一般情況發生變化，動物活動量減少，毛發直豎，灰暗而且無光澤，呼吸明顯急促加快，食欲下降，逐漸消瘦。4周之后各組大鼠均已出現明顯體重下降、呼吸困難、口腔及鼻腔出血、腹水形成，伴隨有肝臟腫大、心臟腫大、右心室室壁增厚等一系列心力衰竭表現。經測量大鼠的右心室壓和肺動脈壓力明顯升高，心輸出量減少，右心室肥厚，肺血管阻力增加，表明應用此法制備的大鼠肺動脈高壓模型成功。實驗過程中發現動物飼養的環境也在實驗中起著重要的作用，必須遠離各種干擾因素。右心導管術導管的改良是實驗數據測量成功的關鍵。用熱稀釋法注入冰生理鹽水的過程中必須準確快速，否則注入的冰鹽水越多，時間次數越多，心排量的測量越不準確，動物越容易死亡。 野百合堿制造動物模型的方法操作比較簡便，并且一次性注射后3周～4周模型即可建立，但是仍然避免不了動物模型后期因為心力衰竭以及肝臟淤血、腹水等原因引起死亡，并且死亡率較高，因此尋找此種方法中相對較為合適的野百合堿造模劑量是進一步進行其他相關研究成功的關鍵。實驗過程中分別采用40 mg/kg、50 mg/kg和 60 mg/kg三種不同劑量的野百合堿來觀察實驗結果的不同，注射后實驗組大鼠在一般情況及血流動力學方面出現不同程度的變化，但高劑量組出現變化的時間明顯早于其他組，嚴重程度也明顯較高。4周以后高劑量死亡率高達53.33%，有數據及實驗表明此種劑量下的大鼠在5周以后死亡率高達35%，右心室的收縮壓甚至達到了80 mmHg，形成重度肺動脈高壓[7-12]，則無法進一步進行其他相關類似藥理及機制方面的研究。雖然低劑量組的肺動脈高壓形成過程較為緩和，4周后死亡率較低，但是最終觀察出的一般情況及血流動力學指標較為接近正常對照組大鼠，出現接近肺高壓損傷的所需時間較長，有數據表明此劑量下大鼠的肺血管損傷增厚及纖維化不明顯。

雖然至今仍沒有一種完美的類似于肺動脈高壓患者的動物模型，但是野百合堿造模仍為現如今較為常用的方法，并且在肺動脈高壓機制的研究及治療中起著重要的作用。綜上所述，必須同時兼顧血流動力學指標達準、血管組織損傷形成和動物的死亡率較低這幾項因素才是成功的動物模型。50 mg/kg體重劑量的野百合堿造模，時間較短，死亡率較低，實驗的重復性和連續性較高，因此試驗顯示此劑量形成大鼠肺高壓模型最為便捷，準確可靠，能為進一步的肺動脈高壓機制研究和治療奠定基礎。

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(本文編輯 郭懷印)

Experimental Study on Different doses of Monocrotaline-induced Pulmonary Hypertension in Rats

Dong Lijun，Chen Peng，Cheng Jiangtao

The First Affiliated Hospital，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450000，Henan，China

Cheng Jiangtao

Objective To investigate the different doses of monocrotaline induced pulmonary hypertension and explore situable monocrotaline dose to model pulmonary hypertension.Methods Sixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups，normal control group，low dose group，middle dose group and high dose group，rats were given subcutaneous injection of appropriate doses of monocrotaline disposably in order to induce the formation of pulmonary hypertension.After our weeks，the pulmonary arterial pressure，cardiac output，pulmonary vascular resistance and right ventricle hypertrophy were measured.Results The mortality rate in high dose group was higher than that in low-dose group and control group.Mean pulmonary arterial pressure and right ventricular wall thickness in high doses group was higher than that in moderate dose group，low dose group，and control group(P<0.001).Cardiac output in high doses group was lower than that in moderate dose group，low dose group，and control group(P<0.001).Conclusion The moderate dose monocrotaline induced pulmonary hypertension is closer to the ideal value model.

pulmonary arterial hypertension；monocrotaline；cardiac output； right ventricle hypertrophy

國家自然科學基金資助項目(No.81273948)

河南中醫學院第一附屬醫院(鄭州 450000)

程江濤，E-mail：chengjt9888@163.com

R563 R256.1

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．10．007

1672-1349(2015)10-1172-04

2015-02-11)