桃金娘根中沒食子酸和總多酚含量測定

銀慧慧 劉 偉 姜源明 孟 菲 覃振華 郭善康 趙 武 孫建華

廣西壯族自治區獸醫研究所袁廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室袁廣西南寧530001

桃金娘根中沒食子酸和總多酚含量測定

銀慧慧 劉 偉 姜源明 孟 菲 覃振華 郭善康 趙 武 孫建華

廣西壯族自治區獸醫研究所袁廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室袁廣西南寧530001

目的測定桃金娘根中沒食子酸和總多酚的含量。方法沒食子酸的含量測定采用超高效液相色譜法。色譜條件院以甲醇-0.5%磷酸(15︰85)為流動相袁采用二級管陣列檢測器(PDA)檢測袁檢測波長為215 nm袁流速為0.2 mL/min。總多酚的含量測定采用分光光度法袁以沒食子酸為對照品袁福林酚試劑為顯色劑袁在748 nm波長下進行測定。結果沒食子酸在3.853~115.6滋g/mL(r=0.9999)濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系袁回收率為98.73%~100.76%。總多酚分析的線性范圍為1.0~7.0滋g/m L(r=0.9995)袁回收率為98.04%~101.17%。結論該方法簡便堯快速堯重現性好袁可用于桃金娘根的質量控制及定量分析。

桃金娘根；沒食子酸；總多酚；超高效液相色譜法；分光光度法

桃金娘[Rhodomyrtus tomentosa(Ait.)Hassk]是一種優良的野生植物資源袁尤盛產于中國和日本的南部等地區[1-2]曰桃金娘根(Radix Rhodomyrti)為桃金娘的干燥根袁含有黃酮苷堯花色苷等黃酮類成分以及植物多糖成分和沒食子酸等化合物多種活性成分[3-5]袁以野通經活血堯收斂止血冶功效收載于葉獸藥國家標準(化學藥品堯中藥卷)第一冊曳中[6]。沒食子酸是可水解鞣質的組成部分[7-8]袁具有抗感染堯抗突變堯抗氧化等多種生物學活性[9-10]。

桃金娘根藥材及飲片質量標準首次收載于農業部葉獸藥規范曳1992版二部[11]袁并未收入以后各版葉中國獸藥典曳袁該質量標準一直沿用至今[12]。該質量標準相對比較簡單袁專屬性不強袁也不夠全面袁未對其所含特征性生物活性成分進行色譜法鑒別袁也未建立科學堯準確堯靈敏的光譜袁色譜及質譜等方法對特征化學成分進行含量測定。因此袁測定桃金娘根中沒食子酸和總多酚含量并對其進行質量評價袁為深入研究其藥物作用機制具有重要意義。本文采用超高效液相色譜法[13-15]和分光光度法分別測定桃金娘根中沒食子酸和總多酚的含量袁方法簡單快捷袁重現性好袁可作為桃金娘沒食子酸堯桃金娘多酚等特征性化學成分定性鑒別或定量檢測的一種方法袁從而完善桃金娘中藥材質量標準袁加強桃金娘根藥材或飲片的質量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters Acquity超高效液相色譜帶二級管陣列檢測器(photo-diode-array袁PDA)袁EmpowerTM3色譜工作站袁配BEH C18色譜柱(2.1 mm伊100 mm袁1.7滋m)(美國Waters公司)曰UV2550紫外-可見分光光度計(日本島津)曰SK7200HP型超聲波清洗器(上?？茖?曰Milli-Q超純水儀(Millipore公司)曰SQP型(精度0.01 mg)電子天平(德國Sartorious公司)曰CAP225D型(精度0.1mg)電子天平(德國Sartorious公司)。

1.2 試劑

甲醇(色譜純袁美國Tedia公司)袁0.2滋m混合濾膜(美國Waters公司)曰沒食子酸對照品(逸98%袁北京恒元啟天化工技術研究院堯北京世紀奧科生物技術有限公司聯合研制)曰福林酚試劑(0.5 mol/L袁上海荔達生物科技有限公司)曰磷酸(分析純袁廣東光華科技股份有限公司)曰桃金娘根藥材院玉林1堯2堯3號(產地廣西玉林袁經廣西植物研究所溫放副研究員鑒定)曰水為超純水。

圖1 沒食子酸對照品和桃金娘根供試品的超高效液相色譜圖

表1 桃金娘根中沒食子酸和總多酚含量(mg/g袁n=3)

2 方法與結果

2.1 沒食子酸測定

2.1.1 色譜條件色譜柱院WatersBEHC18色譜柱(2.1mm伊100 mm袁1.7滋m)曰流動相院甲醇-0.5%磷酸(15頤85)曰流速院0.2mL/min曰檢測波長院215 nm曰進樣量院1滋L[16]。

2.1.2 標準溶液的配制取沒食子酸對照品適量袁精密稱定袁置棕色容量瓶中袁加甲醇制成濃度為115.6滋g/m L的標準儲備液袁放4益冰箱備用。

2.1.3 標準曲線的繪制將沒食子酸對照品溶液按不同倍數稀釋袁按野2.1.1冶項下條件對不同濃度的沒食子酸標準溶液進行色譜分析測定袁以沒食子酸峰面積(Y)對質量濃度(X)進行回歸分析袁得到回歸方程和相關系數為院Y=21040X+4663.4袁r=0.9999(n=6)。結果表明袁沒食子酸在3.853~115.6滋g/mL濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。對57.80滋g/mL沒食子酸標準溶液進行平行測定(n=6)袁峰面積和峰高遷移時間的RSD分別為0.9%和1.1%。圖1A是沒食子酸標準樣品的超高效液相色譜圖。

2.1.4 供試品溶液制備及沒食子酸含量的測定供試品溶液制備院桃金娘根藥材袁打粉袁過五號篩袁取0.3 g細粉袁精密稱定袁置于100 mL具塞錐形瓶中袁精密加入50mL甲醇袁稱定重量袁超聲(350W袁53 kHz袁30益)提取40min袁放冷袁再稱定重量袁用甲醇補足減失的重量袁搖勻袁過濾袁放4益冰箱備用。含量測定時過0.2滋m濾膜后供測試用。沒食子酸含量測定院在野2.1.1冶色譜條件下對供試品溶液進行檢測袁根據標準曲線計算沒食子酸含量。樣品分析色譜圖見圖1B袁桃金娘根中沒食子酸含量見表1。

2.1.5 精密度試驗取桃金娘根藥材(玉林1號)粉末0.3 g袁精密稱定袁按野2.1.4冶制備供試品溶液袁進樣量為1滋L袁重復進樣6次袁測定沒食子酸峰面積袁并計算沒食子酸含量袁測得沒食子酸含量的RSD為1.1%。

2.1.6 穩定性試驗取桃金娘根藥材(玉林1號)粉末0.3 g袁精密稱定袁按野2.1.4冶制備供試品溶液袁在室溫下保存袁分別于0堯1堯2堯4堯6堯8堯24堯36堯48 h測定沒食子酸的峰面積袁測得沒食子酸含量的RSD為0.8%袁表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.1.7 回收率試驗精密稱取已知沒食子酸含量的桃金娘根樣品(玉林1號)9份袁分別向每份添加一定濃度的沒食子酸標準溶液袁每個濃度制備三份平行樣品袁測定其回收率袁結果見表2。

2.2 總多酚含量分析

2.2.1 實驗方法采用紫外-分光光度法對桃金娘根中總多酚進行檢測[17]。精密吸取待測樣品溶液100滋L于10mL容量瓶中袁加入3mL超純水袁搖勻袁再加入0.5mL福林酚試劑袁充分搖勻。1 min后再加入2.5 m L 20% Na2CO3溶液袁用超純水定容至刻度袁混勻。25益下避光反應90 min后袁以顯色劑為空白袁在748 nm波長處測定吸光度A(沒食子酸對照品和桃金娘根供試品吸收光譜圖見圖2)。根據標準曲線袁計算出桃金娘根總多酚的含量。

表2 桃金娘根沒食子酸回收率試驗結果(n=3)

圖2 沒食子酸對照品和桃金娘根供試品的吸收光譜圖

2.2.2 對照品溶液的配制和標準曲線的繪制取沒食子酸對照品適量袁精密稱定袁置棕色容量瓶中袁用超純水溶解袁配制成濃度為98.8滋g/mL標準儲備液。分別精密吸取對照品溶液0堯0.1堯0.3堯0.5堯0.7mL置于10mL棕色容量瓶中袁按野2.2.1冶項進行顯色和測定袁以吸光度A為縱坐標袁濃度C為橫坐標袁進行回歸分析得到線性回歸方程院A=0.0953C+0.0738袁r=0.9995(n= 6)。結果表明袁沒食子酸含量在1.0~7.0滋g/mL范圍內呈現良好線性關系。

2.2.3 供試品的配制和含量分析供試品溶液制備院桃金娘根藥材袁打粉袁過五號篩袁取0.3 g細粉袁精密稱定袁置于100mL具塞錐形瓶中袁精密加入50mL甲醇袁稱定重量袁超聲(350W袁53 kHz袁30益)提取40 min袁放冷袁再稱定重量袁用甲醇補足減失的重量袁搖勻袁過濾袁放4益冰箱備用。含量分析院同野2.2.1冶試驗方法項下進行顯色和測定。根據標準曲線計算總多酚含量袁桃金娘根中總多酚含量見表1。

2.2.4 精密度試驗取桃金娘根樣品(玉林1號)按上述樣品溶液配制方法及測定方法袁測定吸光度值袁重復測定6次袁RSD為0.87%。表明該比色法具有較高的精密度袁重復性好袁可以滿足桃金娘根中總多酚分析的要求。

2.2.5 穩定性試驗評價該比色法在一段時間內的穩定性袁取桃金娘根樣品(玉林1號)按上述樣品溶液處理方法及測定方法袁待比色體系完全反應后袁在25益下繼續放置30堯60堯90堯120堯150min袁然后測定吸光度值袁隨著時間的延長袁其值有下降趨勢袁但幅度不大袁RSD為1.0%。

2.2.6 回收率試驗精密稱取已知總多酚含量的桃金娘根樣品(玉林1號)9份袁分別向每份添加一定濃度的沒食子酸標準溶液袁每個濃度制備三份平行樣品袁按野2.2.1冶方法顯色和含量測定袁計算回收率袁結果見表3。

表3 桃金娘根總多酚回收率試驗結果(n=3)

3 討論

桃金娘是中國南方地區民間傳統習用中草藥袁味甘堯澀堯平袁具有清熱解毒堯收斂止瀉堯理氣止痛堯祛風活絡堯祛瘀止血堯安胎功效袁常用于急堯慢性腸胃炎袁消化不良袁痢疾袁腹瀉袁嘔吐泄瀉袁脘腹疼痛等臨床病癥。隨著桃金娘化學成分研究不斷深入和綜合開發力度不斷加大袁桃金娘化學成分及生物活性研究取得廣泛的研究成果曰鞣酸及多酚類是桃金娘中藥材主要有效化學成分之一袁具有收斂堯止瀉袁抗菌堯抗病毒堯抗腫瘤和抗氧化等生物活性[12]。

采用超高效液相色譜法檢測桃金娘根中沒食子酸含量。對供試品溶液色譜圖中沒食子酸色譜峰進行純度檢查袁并與光譜庫進行匹配袁結果顯示袁色譜峰純度角小于純度閾值袁表明供試品溶液中1.927min處的峰為單一峰曰匹配角度小于匹配閾值袁表明供試品溶液中相應色譜峰的光譜與沒食子酸光譜庫的光譜非常相似袁可認為是同一物質。測得玉林桃金娘根藥材中沒食子酸含量分別為1.73堯1.48堯1.65 mg/g。采用福林酚試劑法和紫外-分光光度法測定桃金娘根中總多酚袁含量分別為79.21堯67.19堯74.33 mg/g。資料表明袁本試驗是對桃金娘沒食子酸堯總多酚進行的首次定量分析研究。

中藥材及飲片的質量標準是保證中藥材及飲片質量袁體現中藥行業管理技術水平先進程度的重要標志曰制訂與國際醫藥行業接軌的中藥材質量標準是促進中藥材走向國際市場堯實現中藥材現代化的有效途徑。本試驗建立的檢測桃金娘沒食子酸超高效液相色譜檢測技術和總多酚含量紫外-分光光度檢測技術袁方法科學堯靈敏度高堯快速堯重復性好袁可作為桃金娘沒食子酸堯桃金娘多酚等特征性化學成分定性鑒別或定量檢測的一種方法袁從而完善桃金娘中藥材質量標準袁加強桃金娘根藥材或飲片的質量控制。同時袁隨著桃金娘化學成分和生物活性研究的不斷深入袁匯集化學成分-藥效-藥理研究成果袁研究更能全面反映桃金娘藥材內核本質的色譜或光譜指紋圖譜袁對桃金娘中藥材種植堯采制堯流通規范化和質量管理的科學化及深入開發桃金娘新制劑均有深遠意義。

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Determ ination of gallic acid and total polyphenol in Radix Rhodom yrti

YIN Huihui LIUWei JIANG Yuanming MENG Fei QIN Zhenhua GUO Shankang ZHAOWu SUN Jianhua
Veterinary Institute of the Guangxi Zhuang Autonomous Region,Guangxi Key Laboratory of Animal Vaccine and New Technology,Guangxi,Nanning 530001,China

Objective To determine the content of gallic acid and total polyphenol in Radix Rhodomyrti.Methods Gal鄄lic acid in Radix Rhodomyrtiwas determined by ultra performance liquid chromatography(UPLC)with photo-diode-ar鄄ray(PDA)at215 nm,and themobile phasewasmethol-0.5%phosphateacid solustion(15頤85)ata flow rate of 0.2mL/min. The content of total polyphenolwas analyzed by spectrophotometry at 748 nm,gallic acid was selected as the reference substance.The colour-developing agentwas Folin-Ciocalteu憶s phenol reagent.Results The linear range for gallic acid and total polyphenol was 3.853-115.6滋g/mL(r=0.9999)and 1.0-7.0滋g/mL(r=0.9995)respectively.The recovery rate of gallic acid was 98.73%-100.76%and recovery rate of total polyphenol was 98.04%-101.17%.Conclusion The method is simple,rapid and good reproducible,can be used for quality control and quantitative analysis of Radix Rhodomyrti.

Radix Rhodomyrti;Gallic acid;Total polyphenol;UPLC;Spectrophotometry

R965

A[文獻標識碼]1673-7210（2015）06（c）-0096-04

院2015-03-20本文編輯院李亞聰)

廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室系統性研究課題(13-051-27-A-6)。

銀慧慧(1983.09-)袁女袁碩士袁從事藥物分析研究。

孫建華(1959.10-)袁男袁研究員袁主要從事生物制藥堯獸藥及天然藥物研究。