γ-生育三烯酚與5 -氟尿嘧啶聯(lián)用對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901 的增殖抑制作用

姜佳佳 孫文廣 屠越華 閻雅更 董鳳麗 葛 聲

5 -FU 是胃癌化學(xué)治療常用的一種細(xì)胞毒性藥物，但其對(duì)患者產(chǎn)生的毒性不良反應(yīng)及耐藥性問(wèn)題使其臨床功效及應(yīng)用受到很大的限制，因此臨床以聯(lián)合應(yīng)用多見(jiàn)［2～6］。

生育三烯酚是維生素E 的一種亞型，目前其對(duì)多種腫瘤細(xì)胞系的抗增殖作用及其與某些藥物聯(lián)合的增敏作用已見(jiàn)報(bào)道，但γ -T3 與5 -FU 聯(lián)合應(yīng)用對(duì)胃癌SGC-7901 細(xì)胞系的增殖抑制作用卻未曾報(bào)道［7～9］。因此，本研究探討了γ -T3 與5 -FU 聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SGC-7901 細(xì)胞系增殖抑制的作用。

材料與方法

1.材料:γ -T3，純度95%，溶于無(wú)水乙醇，購(gòu)于美國(guó)Hygeia 公司。人胃癌細(xì)胞系SGC -7901，購(gòu)自北京市腫瘤研究所。使用含10% 胎牛血清1% 青鏈霉素，1% 谷氨酰胺的RPIM 1640 培養(yǎng)液于37℃，5% CO2恒溫條件下培養(yǎng)，使用0.02%的EDTA 消化傳代。CCK -8 購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所，AnexinⅤ-FITC 細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD 公司。

2.方法:(1)細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(CCK -8 法):將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按照每孔200μl 培養(yǎng)液(10%FBS)，5000 個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板，后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待24h 后，按照分組方式換成含有不同濃度的γ -T3 和5 -FU 的10%胎牛血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，于48h 后分別加入CCK -8 檢測(cè)液用酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度值。(2)流式細(xì)胞分析:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，按照每孔2ml 培養(yǎng)液，3.0 ×104個(gè)細(xì)胞，種于6 孔板中，用10%FBS 培養(yǎng)液種板，24h 后，換成含有不同濃度的γ-T3 和5 -FU 的2%胎牛血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h 后，進(jìn)行凋亡檢測(cè)前處理加入FITC 和PI 染色劑進(jìn)行染色，之后上機(jī)檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1.細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果:5 -FU 和γ-T3 均可抑制SGC-7901 細(xì)胞的增殖，并隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，(P ＜0.05，圖1 中A、B)，增殖抑制作用呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系;而γ-T3(20 或30μmol/L)+5-FU 聯(lián)合應(yīng)用與5-FU 單藥組相比對(duì)SGC-7901 細(xì)胞的增殖抑制作用增強(qiáng)(圖1C)，有增效作用，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t = -3.57，P =0.005;t = -6.856，P =0.000)。通過(guò)CDI 值計(jì)算結(jié)果可以看出，CDI 值均＜1(表1)，說(shuō)明兩藥聯(lián)合的抗腫瘤作用為協(xié)同作用。

2. 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果:5 - FU(30μmol/L)單獨(dú)用藥組凋亡率(7.9% ±0.9%)、T3(20μmol/L)單獨(dú)用藥組凋亡率(38.7% ±1.2%)和5-FU(30μmol/L)+γ -T3(20μmol/L)聯(lián)合用藥組凋亡率(49.4% ±2.2%)與對(duì)照組(3.9% ±0.7%)相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，詳見(jiàn)圖2、圖3。

討 論

圖1 不同藥物不同濃度下SGC-7901 細(xì)胞CCK-8 增殖抑制率

表1 5 -FU、γ-T3 及5 -FU+γ-T3 對(duì)SGC-7901細(xì)胞系生存指數(shù)的影響及其CDI 值

5 -FU 是胃癌治療的常用藥物之一，但是隨著治療的深入，其耐藥性及不良反應(yīng)的增加也成為一個(gè)重要的治療難題［6］。因此，如何提高5 -FU 敏感度，減少耐藥性和不良反應(yīng)就成為臨床上需要迫切解決的問(wèn)題［2～6］。研究表明，生育三烯酚對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制與誘導(dǎo)凋亡的作用，而對(duì)正常組織上皮細(xì)胞不具有明顯毒性不良反應(yīng)［7，8，10］，因此，生育三烯酚被認(rèn)為是一種非常有前途的潛在抗癌劑［4］。

圖2 不同藥物濃度SGC-7901 細(xì)胞凋亡情況

圖3 不同藥物濃度下SGC-7901 細(xì)胞凋亡率

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明了γ-T3 與5 -FU 單獨(dú)應(yīng)用與對(duì)照組相比對(duì)SGC-7901 細(xì)胞具有抑制增殖的作用，并隨著劑量的增加，抑制率也有明顯地增高。兩藥聯(lián)合應(yīng)用與其單獨(dú)應(yīng)用相比對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率具有明顯的升高，這與Guligena 等發(fā)表γ-T3 與抑制素類(lèi)的SMV 和ATV 聯(lián)合應(yīng)用與其分別單獨(dú)用于兩種間皮瘤細(xì)胞系與空白對(duì)照比較產(chǎn)生了非常明顯的生存抑制作用的結(jié)果相同［11～17］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)計(jì)算國(guó)際通用的兩藥相互作用系數(shù)CDI 來(lái)確定兩藥聯(lián)合應(yīng)用是否是協(xié)同作用，當(dāng)CDI ＜1、=1、＞1 時(shí)，分別說(shuō)明兩藥聯(lián)合是協(xié)同作用、相加作用和拮抗作用［1］。本次聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)CDI ＜1 則表明5 -FU 與生育三烯酚聯(lián)合是協(xié)同作用，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合用藥增加了胃癌細(xì)胞系SGC -7901 的凋亡比率，比對(duì)照組和單獨(dú)用藥組有更強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)作用。

以上研究結(jié)果表明γ-T3 與5 -FU 聯(lián)合應(yīng)用與其分別單獨(dú)應(yīng)用同對(duì)照組相比對(duì)SGC -7901 細(xì)胞的增殖抑制作用具有明顯增效作用，并且其抑制作用可能與其促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

1 Chou TC，Talalay P. Quantitative analysis of dose - effect relationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitiors.Adv Enzyme Regul，1984，22:27 -55

2 Zhang N，Yin Y，Xu SJ，et al.5 -Fluorouracil:Mechanisma of Resistance and Reversal Strategies［J］.Molecules，2008，13:1551 -1569

3 劉潔. LY294002 對(duì)胃癌5 -氟尿嘧啶化療增敏作用及研究機(jī)制研究［D］.武漢:武漢大學(xué)，2011

4 黎伯培，陳俊強(qiáng)，劉金祿. 胃癌耐藥細(xì)胞株SGC -7901/5 -FU 的建立及其耐藥機(jī)制的初步探討［J］.消化腫瘤雜志，2012，4:163 -169

5 孫根林，鮑揚(yáng)漪.1，25(OH)2維生素D3和塞萊昔布協(xié)同對(duì)5 -FU 化療的增敏作用［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39(10):74 -77

6 邢國(guó)輝，馮玉光，宗緒山.丹參酮ⅡA 聯(lián)合5 -FU 對(duì)低氧下人胃癌SGC7901 細(xì)胞增殖、凋亡的影響及與HIF-1α 和突變型P53 表達(dá)的關(guān)系［J］世界華人消化雜志，2012，18(3):222 -228

7 KA Manu，MK Shanmugam，Lalitha Ramachandran，et al.First Evidence That γ - Tocotrienol Inhibits the Growth of Human Gastric Cancer and Chemosensitizes It to Capecitabine in a Xenograft Mouse Model through the Modulation of NF-κB Pathway［J］. Clin Cancer Res，2012，18:2220 -2229

8 Amirah Abdul Rahman，A Rahman A Jamal，Roslan Harun，et al.Gamma- tocotrienol and hydroxyl - chavicol synergisitically inhibits growth and induces apoptosis of human glioma cells［J］. BMC Complement＆Alternative Medicine，2014，14:213

9 Margarita González - Vallinas，Susana Molina，Gonzalo Vicente，et al.Antitumor effect of 5 -fluorouracil is enhanced by rosemary extract in both drug sensitive and resistant colon cancer cells［J］. Pharmacological Research，2013，72:61 -68

10 NM Ayoub，MR Akl，PW Sylvester. 2013:Combined γ - tocotrienol and Met inhibitor treatment suppresses mammary cancer cell proliferation，epithelial - to - mesenchymal transition and migration［J］. Cell Prolif，2013，46:538 -553

11 FA Behery，MR Akl，Suryatheja Ananthula，et al.Optimization of tocotrienols as antiproliferative and antimigratory leads［J］. European Journal of Medicinal Chemistry，2013，56:329 -341

12 Chen D，Jiao XL，Liu ZK，et al. Knockdown of PLA2G2A sensitizes gastic cance cells to 5 -FU in vitro［J］. European Review for Medical and Pharmacological Sciences，2013，17:1703 -1708

13 Yap WN，Chang PN，Han HY，et al.Gamma-tocotrienol suppresses prostate cancer cell proliferation and invasion through multiple -signalling pathways［J］. Br J Cancer，2008，99(11):1832 -1841

14 Guligena Tuerdi，Saki Ichinomiya，Hiromi Sato，et al. Synergistic effect of combined treatment with gamma - tocotrienol and statin on human malignant mesothelioma cells［J］. Cancer Letters，2013，339:116 -127

15 MR Akl，NM Ayoub，PW Sylvester.Mechanisms Mediating the Synergistic Anticancer Effects of Combined γ - Tocotrienol and Sesamin Treatment［J］.Original Papers，2012，78:1731 -1739

16 AB Shirode，PW Sylvester.Synergistic anticancer effects of combined γ-tocotrienol and celecoxib treatment are associated with suppression in Akt and NFκB signaling［J］.NIH Public Access，2010，64(5):327-332

17 Paul W，Sylvester.Synergistic anticancer effects of combined c-tocotrienol with statin or receptor tyrosine kinase inhibitor treatment［J］.Genes Nutr，2012，7:63 -74