白術、黃芪、黨參促進IEC-6細胞損傷后的快速修復

宋厚盼， 謝夢洲， 胡志希， 黃惠勇， 蔡 雄

（湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南長沙410208）

白術、黃芪、黨參促進IEC-6細胞損傷后的快速修復

宋厚盼， 謝夢洲， 胡志希， 黃惠勇*， 蔡 雄*

（湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，湖南長沙410208）

目的研究白術、黃芪、黨參提取物對體外胃腸黏膜上皮細胞損傷的快速修復作用。方法采用Tips劃痕法建立小腸上皮 （IEC-6）細胞遷移模型，首先考察不同的IEC-6細胞接種密度、劃痕后修復時間、不同的血清濃度以建立穩定的遷移模型；接著采用表皮生長因子 （EGF）及其阻斷劑AG1478對遷移模型進行評價；最后考察三味中藥對IEC-6細胞遷移的作用效果。結果（1）細胞的最佳接種密度為1×105個/mL；（2）宜在劃痕后8 h計算細胞遷移率；（3）1%血清濃度為最適宜濃度；（4）EGF明顯促進了IEC-6細胞遷移，AG1478明顯抑制了細胞遷移；（5）白術、黃芪、黨參提取物均可促進IEC-6細胞遷移。結論益氣健脾中藥可促進胃腸黏膜損傷后的快速修復過程，其機制是否與影響EGFR信號通路有關有待進一步研究。

胃腸黏膜損傷；IEC-6細胞；細胞遷移模型；表皮生長因子 （EGF）；白術；黃芪；黨參

人體的胃腸黏膜表面上皮代表著胃腸道的一道重要屏障，它能阻止腸腔內的許多毒性物質和免疫原性物質進入機體。胃腸道表面屏障的損傷和破壞常見于各種不同的胃腸道疾病如慢性胃炎、炎癥性腸病等，并且有可能導致毒性和免疫原性物質滲透和吸收的增加，從而使機體產生炎癥、不受控制的免疫反應、以及宿主體內穩態的失調等癥狀［1］。因此，黏膜損傷后的上皮表面屏障的快速修復過程對維持正常的穩態具有重要的作用。

胃腸道黏膜的損傷常來源于藥物、外力、應激、酒精等因素的誘發，胃腸黏膜是人體更新最快的組織之一，通過上皮細胞的快速遷移，其在損傷后具有很強的快速修復能力。上皮表面連續性的重建主要依賴于受損表面附近的上皮細胞遷移至損傷區域并覆蓋裸露的部位，這個過程一般發生于損傷后的幾分鐘至幾個小時不等［2］。

腸上皮（IEC-6）細胞來源于正常大鼠小腸隱窩，它保持了腸上皮干細胞未分化的特性，現普遍將其作為體外模型用于研究人體胃腸黏膜損傷后修復過程。本課題組前期的研究曾采用手術刀片劃痕法考察黏膜損傷后的重建過程，但該方法操作繁瑣，容易產生人為的實驗誤差。為改進實驗方法，提高實驗效率和實驗結果準確性，本研究采用Tips（槍頭）劃痕法建立IEC-6細胞損傷后的遷移模型，通過考察細胞接種密度、培養時間、血清濃度確定該遷移模型，并以表皮生長因子 （EGF）和表皮生長因子受體（EGFR）阻斷劑Tyrphostin AG 1478（AG1478）評價該模型的可靠性，最后采用白術提取物、黃芪提取物和黨參提取物進一步驗證了該模型的準確性。

1 實驗儀器和材料

1.1 細胞株 IEC-6細胞（來源于正常大鼠小腸隱窩），購自美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC，編號C11995，批號8112123）。

1.2 藥材 白術、黃芪及黨參藥材均購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院，經湖南中醫藥大學中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定，白術為菊科植物白術（Atractylodesmacrocephalae Rhizoma）的根莖，黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragali Radix）的根，黨參為桔?？浦参稂h參（Codonopsis Radix）的根。

1.3 儀器 IX-71型熒光相差倒置顯微鏡（Olympus公司）；HW03017-VBA型CO2培養箱（HARRIS公司）；AUM-120D 島津分析天平（SHIMADZU公司）；高壓滅菌器（美國Zealway公司）；TGL-16B離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.4 試劑 高糖DMEM培養基 （批號8112123）、胎牛血清FBS（批號1027885）、Penicillin Streptomycin雙抗溶液（批號1116222），TrypLETMExpress試劑（批號1045845，美國Life technologies公司）；表皮生長因子 （EGF，批號E9644）、選擇性表皮生長因子受體阻斷劑Tyrphostin AG 1478（批號T4182，美國Sigma公司）。其他試劑均為分析純，碧云天生物技術研究所。

2 方法

2.1 白術、黃芪和黨參提取物的制備 精確稱量200 g白術藥材飲片，打粉后加入800 mL 90%的乙醇35℃超聲提取30 min（100W，40 kHz），重復提取3次后用200目紗布過濾所有藥液，并采用0.22μm有機濾膜抽濾，收集濾液得白術乙醇提取液。用旋轉蒸發儀將上述所得白術乙醇提取液濃縮至200 mL左右，真空干燥箱40℃干燥后得25 g白術乙醇提取物 （總得率12.5%，以下簡稱白術提取物）。實驗前以PBS配成所需濃度，實驗劑量以白術提取物重量表示。

準確稱取300 g黃芪藥材，加蒸餾水淹沒藥材浸泡30 min，分兩次煎煮。第一次加入10倍量的蒸餾水 （質量比為黃芪 ∶水=1∶10），武火急煎至沸，再調文火煎煮1.5 h，收集濾液；接著加入6倍量的蒸餾水，文火煎煮1 h，合并兩次濾液，80℃水浴濃縮至300 mL（生藥含量1 g/mL），冷凍干燥得黃芪提取物固體粉末，-20℃保存待用。黨參提取物制備過程同黃芪提取物。實驗前采用PBS溶解黃芪、黨參提取物以制備受試藥。實驗劑量以黃芪、黨參提取物重量表示。

2.2 培養液配制 高糖DMEM加10%FBS、1× 104units/mL青霉素，10 mg/mL鏈霉素。其他濃度血清的培養液均在該配方基礎上加高糖DMEM作相應稀釋。

2.3 細胞培養方法 細胞復蘇后接種于培養瓶，于培養箱37℃，飽和濕度，95%空氣-5%CO2環境培養；隔天換液1次。待細胞生長至80% ～90%時，TrypLE消化液消化細胞，制作單細胞混懸液，血球計數板計數，細胞分別以0.25、0.5、1、2、4、8×105個/m L的密度接種于6孔板 （考察接種密度），每孔加入2.5 mL培養液；加入含10%血清培養液培養48 h后，Tip劃痕法造細胞遷移模型，分別加入含 0%、0.5%、1%、2%、4%、6%胎牛血清的完全培養液 （考察血清濃度），分別培養6、8、10、12、14、16 h后 （考察培養時間），觀察細胞遷移情況。EGF、AG1478和白術提取物則在建立實驗模型后加入培養液，作用質量濃度分別為30、100、50、100、200μg/mL。

2.4 細胞遷移實驗方法 接種細胞前先用紅色標記筆在6孔板各孔底部水平方向劃5條線，便于選取準確的拍照位置。細胞接種于6孔板48 h后，吸棄培養液，用1 mL移液槍頭（Tips）在6孔板各孔中央沿直徑方向輕輕劃一條痕，劃痕時移液槍頭與6孔板成45度角。用PBS清洗細胞表面2次以去除漂浮的細胞和細胞殘骸，吸棄PBS。加入培養液培養相應時間后于劃痕和標記線的交叉部位進行拍照記錄。用NIH Image軟件（版本1.58）測量劃痕面積。IEC-6細胞遷移率等于（S0-ST）/ S0×100% （S0，0小時劃痕形成的面積；ST，培養T h后劃痕形成的面積）。每組3個復孔，所以n=15。

2.5 統計學處理 數據采用均數±標準差 （x±s）表示，采用SPSS 17.0統計軟件分析，數據先進行方差齊性檢驗，然后方差分析，采用Dunnett法進行組間比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 細胞接種密度對IEC-6細胞遷移的影響。課題組首先考察了IEC-6細胞的接種密度對細胞遷移的影響，結果見圖1。數據顯示，當細胞以0.25×105個/mL的密度接種時，遷移率為0，可能是由于數量太少不足以在6孔板各孔中鋪滿，因而不能建立損傷后的遷移模型。當細胞分別以0.5、1、2、4、8×105個/mL的密度接種時，細胞均能貼壁鋪滿，Tips劃痕后8 h觀察，各組的遷移 率 分 別 為 23.95%、36.03%、44.73%、53.50%、56.60%，遷移率隨著密度的增加而提高。實驗過程中還發現，當接種的細胞密度為2或者大于2×105個/mL時，6孔板底部形成了多層貼壁的狀況，培養液中出現大量的漂浮的死細胞，提示接種密度不能大于2×105個/mL。為了使該遷移模型在后續的藥效學實驗中能呈現正向促進和反向抑制的效果，課題組最終選擇1×105個/mL為最佳接種密度。

3.2 劃痕后不同觀察時間IEC-6細胞的遷移情況。

圖1 細胞接種密度對IEC-6細胞遷移的影響Fig.1 Effect of cell density on IEC-6 cellm igration

黏膜損傷后的上皮快速修復與時間緊密相關。本實驗考察了Tips劃痕后不同時間段IEC-6細胞的遷移率。結果見圖2，數據顯示，遷移率隨著培養時間的延長而增加，損傷后6、8、10、12、14 h后遷移率分別為 28.76%、40.00%、51.18%、61.69%、68.97%。由于黏膜損傷后的修復主要包括上皮細胞遷移、增殖和分化等過程，并且隨著損傷時間的增加，細胞增殖和分化逐漸發揮主要作用［3］，本研究旨在建立黏膜損傷修復早期的細胞遷移模型，因此，課題組選擇劃痕后8 h為最佳觀察時間。

圖2 劃痕后不同時間段對IEC-6細胞遷移的影響Fig.2 Effect of scratch at different times on IEC-6 cellm igration

3.3 接種后不同血清濃度對IEC-6遷移的影響

胎牛血清 （FBS）是由血漿去除纖維蛋白而形成的一種很復雜的混合物，它含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因子、激素、無機物等，這些物質可促進體外培養細胞的生長、黏附、增殖［4］。因此，控制血清濃度對IEC-6細胞遷移模型的建立至關重要。圖3結果顯示，在不含血清的培養液中，IEC-6細胞也表現出遷移的能力 （遷移率為11.89%），但細胞形態發生了明顯的變化，缺乏血清導致細胞萎縮、變形、脫落。當血清濃度為0.5%時，細胞狀態稍微改善，遷移率提高至26.56%，但仍然可以在培養液中看見一些懸浮的死細胞。當血清濃度為1%和2%時，遷移率分別提高至40.7%和41.52%，細胞恢復至正常狀態。當血清濃度為4%和6%時，遷移率分別為50.25%和55.63%。以上結果的偏差可能是由于血清濃度的提高促進了IEC-6細胞增殖，細胞數量增加，細胞生長加快。為了使細胞增殖對細胞遷移的影響降到最低，課題組最終選擇1%的血清濃度為最佳培養條件。

圖3 不同血清濃度對IEC-6細胞遷移的影響Fig.3 Effect of different serum concentrations on IEC-6 cellm igration

3.4 IEC-6細胞遷移模型的評價 表皮生長因子（EGF）是機體胃腸道發育和損傷修復的主要營養因子，可促進胃腸上皮細胞遷移，EGF是與靶細胞膜上表皮生長因子受體 （EGFR）結合后發揮生物學效應，EGFR普遍存在于胃壁細胞、十二指腸黏膜上皮細胞和小腸上皮細胞［5］。本實驗采用外源性的EGF和EGFR阻斷劑AG1478來評價Tips劃痕法建立的遷移模型。結果如圖4所示，IEC-6細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板，Tips劃痕后加入含1%FBS的培養液培養8 h，空白組細胞遷移率為42.27%，EGF明顯地促進了IEC-6細胞遷移，細胞遷移率為70.10% （與空白組比較P＜0.01）；加入AG1478則明顯抑制了細胞遷移，遷移率為25.73% （與空白組比較P＜0.01）。該實驗結果提示本課題組建立的IEC-6細胞遷移模型可檢測藥物的正向促進遷移作用和負相抑制遷移作用。

圖4 EGF和AG1478對IEC-6細胞遷移的影響（n= 15，x±s）Fig.4 Effect of EGF and AG1478 on IEC-6 cell m igration.A.diagram of cell m igration induced by Tips scratch；B.quantitative analysis of cell m igration rate of each group（n=15，x±s）

3.5 白術、黃芪、黨參提取物對IEC-6細胞遷移的影響 本課題組前期采用手術刀片劃痕法建立了IEC-6細胞損傷后的遷移模型，并發現益氣健脾中藥白術、黃芪、黨參具有促進IEC-6細胞遷移的作用，其機制可能與影響細胞內多胺信號通路的相關指標表達有關［6-9］。本實驗采用Tips劃痕法遷移模型考察白術提取物對IEC-6細胞遷移的作用效果，旨在進一步驗證Tips劃痕法模型的準確性和可行性。白術提取物對IEC-6細胞遷移的影響結果見圖5A、B?？瞻捉M胞遷移率為 35.78%，低劑量（50μg/m L）的白術提取物并沒有明顯地影響細胞遷移速度 （遷移率為 35.5%），中劑量 （100 μg/mL）和高劑量（200μg/mL）的白術提取物則明顯地促進了IEC-6細胞遷移，遷移率分別為66.43%和67.1% （與空白組比較，均P＜0.01）。

黃芪提取物和黨參提取物對IEC-6細胞遷移的結果見圖5C。本實驗中空白組細胞遷移率為37.63%，50、100、200μg/mL的黃芪提取物均可促進IEC-6細胞遷移，遷移率分別為58.43%、64.32%、65.86%，與空白組比較，均P＜0.01。黨參提取物低、中、高劑量組 （50、100、200 μg/mL）的細胞遷移率分別為59.33%、62.14%和66.25%，均顯著高于空白組細胞遷移率 （與空白組比較，均P＜0.01），提示黨參提取物可促進IEC-6細胞遷移。這些實驗結果與本課題組前期手術刀片劃痕法的結果相吻合，提示本研究建立的Tips劃痕法遷移模型穩定可靠，可以作為實驗模型用于胃腸黏膜損傷后快速修復過程的體外藥效研究。

圖5 白術、黃芪和黨參提取物對IEC-6細胞遷移的影響（n=15，x±s）Fig.5 Effects of Atractylodesmacrocephalae Rhizoma，AstragaliRadix，and Codonopsis Radix extracts on IEC-6 cellm igration（n=15，x±s）

4 討論

人體消化道黏膜表面上皮是由大量的多功能的上皮細胞組成，這些上皮細胞具有很強的再生能力，能保持每24～96 h更新一次。因此胃腸道黏膜在損傷后其表面上皮具有快速重建完整性的能力。上皮表面連續性的重建至少是通過三種不同的機制完成的［10］。首先，靠近損傷部位的上皮細胞向損傷區域遷移，并逐漸覆蓋損傷的裸露部位。這些遷移至損傷區域的上皮細胞并未開始分化，它們的細胞骨架發生重組，接著形成偽足樣結構，當損傷部位完全密封后才開始逐漸分化。本課題組又把這個過程稱為黏膜整復。無論是在體內環境還是體外研究，胃腸黏膜上皮整復均發生在損傷后的幾個小時之內［2］。其次，為了補充細胞池損失的細胞，上皮細胞接著會發生增殖。最后，為維持黏膜上皮的各種功能活性，未分化的上皮細胞逐漸成熟并分化。為方便研究，人為地將黏膜損傷修復劃分為三個過程，事實上，這3種痊愈機制在體內并不是三個獨立的過程，它們往往相互重疊，本研究主要討論的是黏膜損傷后的第一個快速修復步驟—上皮細胞遷移過程。

IEC-6細胞來源于正常大鼠的小腸隱窩，其未分化的特性很好的模擬了人體的胃腸黏膜環境，人們普遍將其應用于胃腸黏膜損傷的體外研究［11］。目前對IEC-6細胞損傷模型研究最多的兩個學術團隊分別是美國馬里蘭大學的Jian-ying Wang團隊［12］和美國田納西州大學健康科學中心的Leonard R. Johnson團隊［13］。前者主要采用手術刀片劃痕法建立IEC-6細胞損傷模型，后者則采用Tips劃痕法建立IEC-6細胞損傷后遷移模型。本課題組前期采用手術刀片劃痕法建立IEC-6細胞遷移模型，研究發現許多益氣健脾中藥的不同提取部位如黃酮、皂苷、多糖部位均可促進IEC-6細胞遷移，其機制與影響細胞內多胺含量有關［8-9，14-15］。但在實驗中手術刀片劃痕法對實驗者要求甚高，為了達到理想的實驗效果，需花大量的時間進行練習；即使是熟練操作的實驗人員在同一次實驗中也不可能全部劃出又細又直的劃痕，而劃痕的粗細直接影響細胞遷移的速度，因此劃痕的質量直接決定了實驗結果；由于手術刀片劃痕法存在操作不便、易產生誤差和假陽性結果等缺點，因此本研究考察了另一種劃痕損傷的方法，即Tips劃痕法。

為建立穩定、可靠的Tips劃痕法模型，本研究對IEC-6接種的細胞密度、劃痕后培養時間和培養液中血清濃度進行了考察，并采用具有促進細胞遷移作用的EGF、白術提取物、黃芪提取物和黨參提取物以及具有抑制細胞遷移作用的EGFR受體阻斷劑AG1478進行了驗證。結果發現，當IEC-6細胞接種數量為1×105個/mL，給藥后培養時間8 h以及1%的血清濃度為建立Tips劃痕法模型的最佳條件。在驗證該模型時，發現EGF顯著地促進了IEC-6細胞遷移，AG1478則抑制了IEC-6細胞遷移，同時發現中劑量和高劑量 （100和200 μg/mL）的白術提取物可促進IEC-6細胞遷移，此外，50、100、200μg/mL的黃芪提取物和黨參提取物均可促進IEC-6細胞遷移。這些結果提示Tips劃痕法建立的遷移模型具有可靠性和穩定性的特點。

祖國醫學認為，脾胃為氣血生化之源，后天之本。脾虛證患者和大鼠的胃腸黏膜都表現出上皮細胞脫落、壞死的情況。因此可以認為胃腸黏膜損傷是脾虛證的重要病理基礎［16］。胃腸黏膜保護是中醫 “脾”功能的重要內容，也是益氣健脾中藥的重要作用機制之一。本課題組前期的研究發現益氣健脾中藥促進胃腸黏膜損傷后修復的作用機制與增加細胞內多胺水平有關。而在本研究建立Tips劃痕法后，課題組的研究將從多胺介導的相關信號通路轉向EGFR介導的下游信號通路，Tips劃痕法模型的建立為本課題組后續的研究建立了良好的工作基礎。

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Study on the effect of Baizhu，Huangqi，and Dangshen on promoting IEC-6 cell repair after injury

SONG Hou-pan， XIE Meng-zhou， HU Zhi-xi， HUANG Hui-yong*， CAIXiong*
（Institute of TCM Diagnostics，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

AIMTo study the effect of Baizhu（Atractylodesmacrocephalae Rhizoma），Huangqi（Astragali Radix），and Dangshen（Codonopsis Radix）extracts on the rapid repair of gastrointestinal mucosa injury in vitro.METHODSThe gastrointestinalmucosa injurymodel was established by Tips scratch method.The effect of three kinds of extracts on the repair was studied in three areas：different cell seeding densities，rapid repair time after the scratch，and serum concentration.The cellmigrationmodelwas then evaluated by EGF and AG1478.Finally，we examined the effectof three kinds of extracts on IEC-6 cellmigration.RESULTS（1）The optimal culture density of intestinal epithelial cell（IEC-6）was1×105 cells/mL；（2）IEC-6 cellmigration rate should be calculated 8 h after scratch；（3）The serum concentration of 1%was the most suitable concentration；（4）Epidermal growth factor（EGF）significantly promoted IEC-6 cellmigration，while AG1478 significantly inhibited IEC-6 cellmigration；（5）Baizhu，Huangqi，and Dangshen extracts all increased the rate of IEC-6 cellmigration.CONCLUSIONTraditional Chinesemedicines of replenishing qi to invigorate the spleen can promote the repair of gastrointestinalmucosal injury，whether the mechanism is related to EGFR signaling pathway remains to be further studied.

gastrointestinalmucosal injury；intestinal epithelial cell；cellmigration model；epidermal growth factor（EGF）；Bazhu（Atractylodesmacrocephalae Rhizoma）；Huangqi（Astragali Radix）；Dangshen（Codonopsis Radix）

R285.5

：A

：1001-1528（2015）06-1170-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.004

2014-10-28

國家自然科學基金項目 （81373540）；湖南省中醫藥科研計劃重點項目 （201308）；湖南省教育廳科學研究重點項目（12A107）；湖南中醫藥大學中醫診斷學國家重點學科開放基金項目 （2013ZYZD10）；湖南省科技重大專項 （2014FJ1007）

宋厚盼 （1988—），男，博士，講師，從事中醫診斷學和中藥消化道藥理學研究工作。E-mail：pansyy-2008@163.com

*通信作者：蔡 雄 （1976—），男，博士，教授，博士生導師，從事中藥抗炎免疫藥理學和分子生物學與遺傳學研究。E-mail：caix12@qq.com黃惠勇 （1963—），男，博士，教授，博士生導師，從事中醫病證診斷規范及信息處理研究。E-mail：huanghy@126.com