DART-Orbitrap質譜法快速定性定量分析延胡索

王 洋， 李樂樂， 李 波， 郭云龍， 劉淑瑩，2*

（1.長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春130117；2.中國科學院長春應用化學研究所，吉林長春130022）

DART-Orbitrap質譜法快速定性定量分析延胡索

王 洋1， 李樂樂1， 李 波1， 郭云龍1， 劉淑瑩1，2*

（1.長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春130117；2.中國科學院長春應用化學研究所，吉林長春130022）

目的建立一種對延胡索進行快速簡便的定性鑒別和定量檢測方法。方法采用DART-Orbitrap質譜法進行檢測，對延胡索中的化學成分進行對照品比對和二級質譜確證，采用Full MS-SIM/Targeted-MS2掃描方式采集信號，并對延胡索乙素母離子和子離子的提取離子流圖積分。結果在延胡索中檢測出延胡索甲素和乙素的質子化離子峰，m/z分別為356.18和370.20，定量方法具有良好精密度和穩(wěn)定性，延胡索乙素的線性范圍為0.106～0.848μg/mL，r=0.997 0，平均加樣回收率114.1%。結論該方法定量分析時快速精確，并且定性鑒別時無需對樣品進行前處理。

：實時直接分析（DART）；Orbitrap質譜；延胡索；定性定量分析

實時直接分析（direct analysis in real time，DART）離子源是一種新型的敞開式大氣壓電離技術，在2005年由 Cody等［1］首次提出，同年由JOEL和IonSense公司將其商業(yè)化。這種電離技術不需要對樣品進行復雜的前處理，能在幾秒鐘時間內分析存在于氣體、液體、固體或材料表面的化合物，對樣品消耗量較低，而且分析過程中不需要引入大量的有機溶劑。DART可以與多種質譜儀相聯(lián)，如飛行時間質譜［2-3］、四級桿質譜［4］、離子阱質譜［5］等，可應用于食品安全［6-7］、 爆炸物檢測［8］、藥品非法添加等方面［9-10］，但是在中藥材快速定性和定量方面的應用相對較少［11-13］。

傳統(tǒng)中藥材鑒定方法包括基源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定四大類，各種方法都有其特點和適用對象，有時候還需要幾種方法配合才能完成對一種中藥材的準確鑒定。在 《中國藥典》中關于中藥材的鑒別項下，常用的鑒別方法是薄層色譜法，該方法操作繁瑣，浪費時間，過程中需要大量有機溶劑，污染環(huán)境。因此非常有必要建立一種原位、快速、綠色的鑒定中藥的方法。

本研究以延胡索藥材為代表，利用DART-Orbitrap質譜技術對其進行檢測，并對實驗參數(shù)進行優(yōu)化，建立了一種原位、簡便、快速、綠色的中藥材定性定量的方法。

1 儀器與材料

DART離子源 （包括自動滑軌、載樣熔點管、十孔載樣器、載樣篩網(wǎng)，美國Ion Sense公司）；QExactive Orbitrap質譜儀（Xcaliber工作站，美國賽默飛世爾公司）。甲醇 （色譜純，美國TEDIA公司）；高純氮氣、氦氣 （純度＞99.999%，長春巨洋氧氣廠）；延胡索乙素 （北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，批號130828）；延胡索藥材由長春中醫(yī)藥大學中藥鑒定實驗室提供。

2 方法與參數(shù)

2.1 檢測條件

2.1.1 DART條件 離子化氣體為氦氣；待機氣體為氮氣；氣體壓力為0.5 MPa；氣體溫度為300℃；其他參數(shù)采用儀器默認設置；采用篩網(wǎng)進樣方式；載樣器滑動速度為0.2 mm/s；正離子模式采集。

2.1.2 Orbitrap質譜條件 掃描范圍m/z50～750；分辨率為35 000；AGC target 1×10-6；正離子模式；掃描方式為Full MS-SIM/Targeted-MS2；碎裂電壓NCE為35；DART離子源與質譜儀入口之間的距離為1 cm。

2.2 樣品制備 精密配制1 mg/mL的延胡索乙素對照品溶液，作為貯備液。精密稱取延胡索粉末2 g，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲提取10 min，放冷，用甲醇補足至刻度線，混勻，離心（12 000 r/min，10 min），取上清液作為供試品，即得。用熔點管蘸取樣品溶液置于氦氣流中檢測，或者用移液槍吸取樣品點在載樣篩網(wǎng)上，每次檢測時間為6 s，每個樣品重復檢測3次。

3 結果和討論

3.1 氦氣溫度的選擇 DART離子源工作氣體和溫度是影響離子化效果和信號強弱的主要因素，也是DART方法開發(fā)時應該重點考慮的參數(shù)。本實驗選取了DART研究中最常用的兩種氣體氮氣和氦氣分別進行測試，結果發(fā)現(xiàn)，高純氦氣作為工作氣體時，離子峰的強度和檢測限明顯優(yōu)于氮氣，這與文獻［11］報道一致，所以選擇高純氦氣作為DART的工作氣體。

同時，我們也對工作氣體的溫度進行了優(yōu)化，選用 《中國藥典》規(guī)定的延胡索乙素為指標，結果如圖1（A）所示。溫度從50℃升高到450℃，溫度間隔為50℃，在100℃下可以觀測到質子化的延胡索乙素m/z356.18［M+H］+，但是背景干擾較大，信噪比較低。隨著溫度升高，m/z356.18的強度逐漸增大，當溫度到達300℃時，強度趨于平穩(wěn)，至450℃時保持恒定。有文獻［11］報道，高溫可能導致樣品分解或焦化，因此本實驗選擇300℃作為檢測的溫度。

圖1 延胡索乙素離子強度隨溫度的變化曲線（A）和其在300℃時的DART-M S譜圖（B）Fig.1 Signal intensity of tetrahydropalmatine ion on different helium gas tem peratures（A）and DART mass spectrum of tetrahydropalmatine at 300℃（B）

3.2 掃描方式的選擇 本實驗對比了Full MSSIM/Targeted-SIM和Full MS-SIM/Targeted-MS2兩種掃描方式。在Full MS-SIM/Targeted-SIM中，利用質子化延胡索乙素的精確相對分子質量，對總離子流圖進行提取，并對其峰面積積分；在Full MSSIM/Targeted-MS2中，對m/z 356.18進行串聯(lián)（圖2A），得到m/z192.10碎片離子，在定量時選擇m/z356.18和m/z192.10對總離子流圖進行提取，并對提取離子流圖的峰面積進行積分。以上兩種掃描方式，在對延胡索對照品進行檢測時差別不大，但是對延胡索藥材檢測時，由于藥材中成分較多，會對檢測結果造成一定干擾，因此本實驗選擇Full MS-SIM/Targeted-MS2掃描方式，以提高定量的準確度。

3.3 定性檢測 熔點管蘸取延胡索提取液置于氦氣流中，用DART-Orbitrap MS采集信號，結果如圖3A所示。在質譜圖中，可以看到有質子化的延胡索乙素峰 （m/z 356.181 0），另外還檢測到了m/z370.159 3、m/z384.176 2、m/z322.103 1和m/z342.165 4。通過對比精確相對分子質量，確定m/z370.159 3為延胡索甲素，我們對m/z 356和m/z 370進行碎裂，碎裂機理如圖3所示。同時，本實驗還對延胡索藥材進行直接檢測，檢測結果如圖3B所示。得到的質譜圖與延胡索提取液譜圖一樣，盡管背景干擾較大，信號強度較低，但是對于藥材的定性鑒別來說影響不大。實驗結果說明，DART-MS技術可以用來對延胡索進行定性檢測，與傳統(tǒng)的薄層色譜方法相比，具有速度快、節(jié)省有機溶劑、無需樣品前處理等優(yōu)點，另外多個指標同時定性還提高了結果的可信度。

圖2 延胡索乙素 （A）和延胡索甲素 （B）的串聯(lián)質譜圖Fig.2 DART tandem m ass spectra of tetrahydropalm atine（A）and corydaline（B）

圖3 延胡索提取液（A）和延胡索藥材（B）的DART-MS譜圖Fig.3 DARTmass spectra of extracting solution of Corydalis Rhizoma（A）and Corydalis Rhizoma medicinalmaterial（B）

3.4 定量檢測 依據(jù) 《中國藥典》中對延胡索藥材的規(guī)定，本實驗選取延胡索乙素作為定量檢測的指標。同時，對載樣方式進行優(yōu)化。由于熔點管進樣無法準確控制載樣量，而篩網(wǎng)進樣可以用移液槍進行控制，所以實驗中選擇篩網(wǎng)作為載樣的方式。另外，對滑軌滑動速度進行優(yōu)化時，發(fā)現(xiàn)如果以較快的速度進行滑動，篩網(wǎng)上的樣品無法被完全離子化，影響方法的線性關系。通過對比，確定滑軌滑動的速度為0.2 mm/s。測定發(fā)現(xiàn)，該方法對延胡索乙素的檢測限為10.6 ng。

3.4.1 精密度試驗 取質量濃度為0.106μg/m L的對照品溶液5μL，點樣至篩網(wǎng)上，按 “2.1”項下條件進行檢測，重復測定6次，以延胡索乙素提取離子流圖的峰面積計算。結果，RSD為4.3%，表明儀器的精密度良好。

3.4.2 重復性試驗 取同一批次延胡索藥材，按照 “2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，分別取5μL，點樣至篩網(wǎng)上，按 “2.1”項下條件進行檢測，以延胡索乙素提取離子流圖的峰面積計算。結果，RSD為 5.3%，表明該方法重復性良好。

3.4.3 線性關系考察 精密吸取對照品貯備液適量，分別配制成質量濃度為 0.106、0.212、0.318、0.424、0.530、 0.636、0.742、 0.848 μg/mL的對照品溶液，分別吸取上述對照品1μL，點樣至篩網(wǎng)上，載樣器滑動速度為0.2 mm/s，進行檢測。以峰面積 （Y）和對照品質量濃度 （X）進行回歸分析，得到延胡索乙素的回歸方程為Y= 7.16×106X-2.43×108，r=0.997 0。結果表明，延胡索乙素在0.106～0.848μg/mL范圍內線性關系良好。

3.4.4 回收率試驗 取已測定含有量的同一批次延胡索藥材，按照 “2.2”項下方法制備供試品溶液，分別吸取10μL供試品溶液5份，點樣至載樣篩網(wǎng)上，溶劑揮干后，再分別吸取0.106μg/m L的對照品溶液2μL點樣于載樣篩網(wǎng)上，將篩網(wǎng)置于滑軌上，測定延胡索乙素的量。結果，計算其回收率分別為119.0%、102.8%、99.1%、123.1%和126.7%，加樣回收率的范圍在99.1%～126.3%之間，平均加樣回收率為114.1%。

4 結論

本實驗建立了一種快速定性定量分析的方法，采用DART離子源結合高分辨Orbitrap質譜對延胡索進行檢測，完成一次檢測僅需要6 s。在定性鑒別時，無需對樣品進行前處理，直接將藥材置于電離區(qū)，通過質譜信號的精確相對分子質量進行定性鑒別。相比于常用的薄層色譜法，該方法具有操作簡便、檢測速度快、不需要引入有機試劑等特點，另外多種成分的同時定性提高了鑒別的準確性。在定量分析的準確度和重復性上，該方法相比于傳統(tǒng)的色譜方法稍顯遜色，但是其所具有的實時、快速、綠色和無需或者只需很小的樣品前處理等優(yōu)點，將在中藥材或中成藥的高通量篩查、快速定性鑒別、快速定量以及質量控制上顯示出強大的優(yōu)勢。若能與小型便攜式質譜結合，它定能更好地發(fā)揮其原位檢測、現(xiàn)場檢測和實時分析的優(yōu)點。

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Rapid qualitative and quantitative analysis of Corydalis yanhusuo by DART-Orbitrap mass spectrometry

WANG Yang1， LILe-le1， LIBo1， GUO Yun-long1， LIU Shu-ying1，2*
（1.Jilin Ginseng Academy，Changchun University of ChineseMedicine，Changchun 130117，China；2.Changchun Institute of Applied Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130022，China）

AIMTo establish a rapid and simple method for qualitative and quantitative analysis of Corydalis Rhizoma.M ETHODSDART-Orbitrap mass spectrometry was used to analyze the sample as compared withstandard sample.And the full scan spectra and secondary spectra were also adopted for the component identification.The fullMS-SIM/Targeted-MS2mode was applied to determining themass spectrum.Extract ion chromatography was used for quantitative analysis.RESULTSThe protonated molecule ion of corydaline and tetrahydropalmatine were observed in Corydalis Rhizoma based on the m/z356.18 and 370.20.The quantitative analysis demonstrated with good reproducibility，the linear of tetrahydropalmatine was in the range of 0.106-0.848μg/mL（r=0.9970），and the average recovery rate was 114.1%.CONCLUSIONThemethod is rapid and accuracy in the quantitative analysis，and does not need the pretreatment of samples in the qualitative analysis.

directanalysis in real time（DART）；Orbitrap mass spectrometry；Corydalis Rhizoma；qualitative and quantitative analysis

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1279-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.026

2014-08-07

國家自然科學基金項目 （21175127）

王 洋 （1986—），男，碩士，實習研究員，從事中藥化學和代謝組學研究。Tel：（0431）86045256，E-mail：white-wing@ 163.com

*通信作者：劉淑瑩（1943—），女，博士，研究員，博士生導師，從事質譜分析研究。E-mail：syliu@ciac.ac.cn