補骨脂和肉豆蔻炮制對脾腎陽虛泄瀉大鼠能量代謝的影響

陳志敏， 胡昌江， 潘 新， 趙 玲， 熊 瑞， 耿媛媛， 胡 麟

（成都中醫藥大學藥學院，四川成都611137）

補骨脂和肉豆蔻炮制對脾腎陽虛泄瀉大鼠能量代謝的影響

陳志敏， 胡昌江*， 潘 新， 趙 玲， 熊 瑞， 耿媛媛， 胡 麟

（成都中醫藥大學藥學院，四川成都611137）

目的從能量代謝角度比較二神丸中補骨脂、肉豆蔻炮制前后對脾腎陽虛泄瀉大鼠的調控效應。方法采用腺嘌呤灌胃，飲食失節，服冰番瀉葉水浸劑方法復制脾腎陽虛泄瀉大鼠模型，給藥二神丸進行治療性實驗，酶標儀法檢測大鼠肝組織中Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase以及乳酸脫氫酶（LDH）活性變化；比色法檢測肝組織中琥珀酸脫氫酶（SDH）活性變化。結果與正常對照組比較，模型組肝組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性顯著降低 （P＜0.01）；LDH活性顯著升高 （P＜0.01）。與模型組相比較，二神丸Ⅳ組 （鹽炙補骨脂+麩煨肉豆蔻）Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性明顯升高，LDH活性明顯降低，均具有極顯著性差異（P＜0.01）；與二神丸Ⅰ組（補骨脂生品+肉豆蔻生品）相比較，二神丸Ⅳ組Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性均高于二神丸Ⅰ組，差異有統計學意義 （P＜0.05）；LDH低于二神丸Ⅰ組，差異有統計學意義 （P＜0.05）。結論經鹽炙補骨脂和麩煨肉豆蔻組方的二神丸改善脾腎陽虛泄瀉模型大鼠能量代謝效果更加明顯，提示其增效可能與促進能量代謝相關酶活性有關。

二神丸；補骨脂；肉豆蔻；炮制；能量代謝；ATP；琥珀酸脫氫酶；乳酸脫氫酶

二神丸出自宋·許叔微的《普濟本事方》，以補骨脂和肉豆蔻組成，具有溫腎暖脾、澀腸止瀉之功效，臨床上常用于脾腎陽虛之腎泄證，亦稱“五更泄”、“雞鳴瀉”。方中補骨脂辛苦性溫，補命門之火以溫養脾土，為君藥；以肉豆蔻溫中澀腸為臣藥，與補骨脂相伍，既可增強溫腎暖脾之力，又能澀腸止瀉。在前期研究中已經證明二神丸復方中補骨脂、肉豆蔻分別經鹽炙和麩煨后組方入藥能增強固澀止瀉的作用［1-2］，但方中藥物炮制前后對于 “五更瀉”的作用機制目前尚無研究。

現代研究表明，脾腎陽虛會造成機能減弱或衰退、代謝減緩、產熱不足的病理狀態，患者常出現畏寒肢冷、精神不振、喜靜萎靡等癥狀，與現代醫學理論中的基礎代謝率及能量代謝水平下降而導致的供能不足所表現的癥狀相似［3-5］。本實驗將補骨脂、肉豆蔻納入二神丸，從能量代謝的角度，以產熱低下、代謝減緩為切入點，借助脾腎陽虛泄瀉模型，對補骨脂、肉豆蔻炮制前后組方進行探討，為二神丸中藥物炮制增效的機理以及今后中醫臨證處方正確選用炮制品提供一定的理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠，雄性，體質量200～220 g，由四川達碩動物實驗中心提供。實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2013-24。

1.2 實驗儀器 電子天平 （賽多利斯科學儀器（北京）有限責任公司）；TGL-16B型離心機（上海安亭科學儀器廠）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波長多功能讀數儀（美國Thermo公司）

1.3 實驗藥物與試劑 補骨脂和肉豆蔻均購于成都市荷花池藥材市場，經成都中醫藥大學盧先明教授鑒定分別為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實和肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥種仁。番瀉葉，購于四川千方中藥飲片有限公司，批號20130101。

腺嘌呤購于成都貝斯特試劑有限公司，批號D110160；Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、琥珀酸脫氫酶 （SDH）測試盒，購自南京建成生物工程研究所，批號 20140404；乳酸脫氫酶（LDH）測試盒、考馬斯亮藍蛋白定量測試盒，購自南京建成生物工程研究所，批號20140408。

2 實驗方法

2.1 藥物炮制及藥液的制備

2.1.1 鹽炙補骨脂 取補骨脂藥材，加入藥材量一半的食鹽水（質量濃度為0.02 g/m L），室溫悶潤24 h，于150℃炒制10 min后置托盤中于50℃鼓風烘箱中烘干。

2.1.2 麩煨肉豆蔻 取肉豆蔻生品與麥麩 （100 g∶40 g）同置鍋內，文火加熱，溫度控制在130～150℃，翻炒20 min，至麥麩呈焦黃色，肉豆蔻呈棕褐色。

2.1.3 番瀉葉水浸劑 冷水浸1 h，后加水煮沸約10 min后過濾，減壓濃縮成1.0 g/mL的藥液。

2.1.4 二神丸藥液 補骨脂和肉豆蔻的量按 《中藥大辭典 （方劑分冊）》中的2∶1比例配比，即補骨脂生品+肉豆蔻生品 （100 g∶50 g）、補骨脂生品+麩煨肉豆蔻 （100 g∶50 g）、鹽炙補骨脂+肉豆蔻生品 （100 g∶50 g）、鹽炙補骨脂+麩煨肉豆蔻 （100 g∶50 g），粉碎成粗粉，醇水雙提 （先用8倍量的75%的乙醇回流提取1.5 h，過濾，藥渣用8倍量的75%的乙醇回流提取1 h，過濾，藥渣用10倍量的水回流提取1 h，過濾，藥渣用10倍量的水回流提取0.5 h，合并濾液）后濃縮配制成質量濃度0.35 g/m L藥液。

2.2 動物分組及模型制備 將48只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型組、二神丸Ⅰ組 （補骨脂生品+肉豆蔻生品）、二神丸Ⅱ組 （鹽炙補骨脂+肉豆蔻生品）、二神丸Ⅲ組 （補骨脂生品+麩煨肉豆蔻）、二神丸Ⅳ組 （鹽炙補骨脂+麩煨肉豆蔻）共6組。除正常對照組之外，其余各組均按以下方法進行復合造模：腺嘌呤200 mg/kg劑量，用前配制成懸濁液 （2 g/100 mL生理鹽水），灌胃4周致腎陽虛；單日、雙日交替喂飼甘藍 （10g/只）和精煉豬油（2 mL/只）致飲食失節，附以每日下午游泳致勞倦過度以傷脾氣，從第3周起在之前造?；A上再通過給予灌服冰番瀉葉水浸劑，以1 mL/100 g體質量劑量灌胃2周達以傷脾陽［6-9］。同時第3周起 “二神丸”各組均按3.5 g/kg劑量，連續灌胃給藥2周。

經過上述方法造模后大鼠出現飲水攝食量減退，活動減少，體質量減輕，體毛枯疏、失去光澤，大便溏泄、尿量增多，倦怠嗜臥，體溫下降、畏寒蜷縮喜扎堆，個別動物出現脫肛，甚至死亡等一系列與類似中醫 “脾腎陽虛”狀態［10］，并且在造模第2周起出現稀便，第3周出現溏泄；此外，該復合造模方法實驗室前期研究結果顯示造模后大鼠血清cAMP下降，cGMP上升，cAMP/cGMP比值明顯下降，差異有統計學意義 （P＜0.01），表明脾腎陽虛泄瀉大鼠模型造模成功。實驗共進行4周，結束次日處死并取樣 （取樣前禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，頸部脫臼處死，迅速剖開腹腔取出肝組織。）。

2.3 肝組織勻漿的制備及蛋白定量 參照南京建成組織勻漿上清液制備實驗方法學。實驗之前將生理鹽水預冷，用生理鹽水快速洗盡組織上血液后，用濾紙將其拭干。準確取肝組織稱定質量，按質量（g）∶體積 （mL）=1∶9的比例，冰袋上快速地剪碎組織塊后倒入玻璃勻漿器中，冰水浴條件下勻漿，2 500 r/min離心10 min。取上清液（即10%的勻漿上清液），再用生理鹽水10倍稀釋成1%。肝組織勻漿按照考馬斯亮藍蛋白定量測試盒說明書進行蛋白定量，蛋白質量濃度=（測定管OD值-對照管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）×對照品質量濃度 （0.563 g/L）。

2.4 肝組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性變化 按ATPase試劑盒說明書要求進行規范化操作，用酶標儀測定吸光度。再根據公式計算，ATPase活力=（測定管OD值-對照管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）×標準管濃度（0.02μmol/mL）×反應體系中樣本稀釋倍數× 6÷勻漿蛋白濃度。

2.5 肝組織SDH、LDH活性變化 按照SDH測試盒說明書要求進行規范化操作，用分光光度計在600 nm處比色，分別讀取反應5 s、65 s時的吸光光度值（OD5 s、OD65 s），再根據公式計算，組織中SDH活性=［OD5s-OD65s）/0.01］/［反應時間min×（取樣量mL×勻漿蛋白濃度）］；

按照LDH測試盒說明書要求進行規范化操作，用酶標儀測定吸光度。再根據公式計算，組織中LDH活性=（測定管OD值-對照管OD值）/（標準管OD值-空白管OD值）×標準管濃度（0.2μmol/mL）÷勻漿蛋白濃度。

2.6 統計方法 采用Spss 19.0統計軟件做數據處理，計量資料以 （x±s）表示。采用單因素方差分析，以P＜0.05時認為有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 肝組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性變化 與正常對照組相比較，模型組大鼠Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低（P＜0.01），表明機體處于供能不足、能量代謝低下、代謝紊亂，這與模型大鼠的狀態相符，給藥二神丸能提高Na+-K+-ATPase與Ca2+-Mg2+-ATPase活性，從而促進ATP的分解，保持細胞內外正常的離子濃度和膜電位，調節機體能量代謝。在二神丸四個組合中，以二神丸Ⅳ組相對于其他組效果最佳 （具體結果見表1）。

表1 各組大鼠肝組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-M g2+-ATPase活性的比較（U/mgprot）（x±s）Tab.1 Comparison of the Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activity in rats liver among different groups（U/mgprot）（x±s）

3.2 肝組織SDH、LDH活性變化 與正常對照組相比較，模型組大鼠SDH活性降低，LDH活性明顯升高，二者均有極顯著性差異 （P＜0.01），說明機體有氧氧化供能不足，能量代謝低下。給藥二神丸后，大鼠SDH活性升高，LDH水平下調，從而改善機體細胞的能量代謝，使肝臟維持正常的代謝功能，機體處于代謝旺盛狀態，且在四種組方中二神丸Ⅳ組效果更好 （具體結果見表2）。

4 討論

二神丸是臨床治療五更泄瀉的基礎方，其病機在于脾腎陽虛。補骨脂鹽炙后可引藥入腎，增強溫腎助陽、納氣止瀉的作用，現代研究表明，補骨脂炮制后，補骨脂素和異補骨脂素含有量降低，但其吸收明顯增加［11］，與 “腎”關系密切的微量元素Mn、Ca、Mg、Fe、Zn含有量增加［12］；肉豆蔻煨制可增強固腸止瀉的作用，研究表明煨制后肉豆蔻中甲基丁香酚、甲基異丁香酚等是其揮發油止瀉的主要有效成分，經過炮制后這兩種成分明顯增加［13］。Ca、Mg、Zn等微量元素在免疫調節和能量代謝方面起著重要作用，并且炮制后有效成分及吸收速率的增加也能增強療效，但這些研究多局限于單味藥，鮮有基于復方的研究。因此本實驗將補骨脂和肉豆蔻的生品和其炮制品組合配方，得到4個組，以 “脾腎陽虛泄瀉”大鼠模型為研究對象進行考察。

表2 各組大鼠肝組織SDH、LDH活性的比較（U/mgprot）（x±s）Tab.2 Com parison of the SDH and LDH activity in rats liver am ong different groups（U/mgp rot）（x±s）

實驗結果顯示，經復合因素造模后模型大鼠肝組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性顯著降低，LDH水平升高，表明模型大鼠發生能量代謝的紊亂，給藥二神丸后，上述指標均較模型組有所改善，使機體能量代謝處于活躍狀態，且二神丸Ⅳ組的作用優于其他3組，說明 “二神丸”中補骨脂和肉豆蔻分別經過鹽炙和煨炙后對脾腎陽虛的治療效果最好。

本實驗從能量代謝角度，闡明了二神丸中補骨脂、肉豆蔻炮制前后組方入藥對 “五更瀉”本質脾腎陽虛的影響。提示二神丸能提高脾腎陽虛大鼠低下的能量代謝水平，尤以補骨脂、肉豆蔻均炮制后組方入藥效果更佳，因此臨床上在治療脾腎陽虛之腎泄證時，應以鹽炙補骨脂和煨制肉豆蔻入藥更好。

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Effect of processed Buguzhi and Roudoukou on energy metabolism in rats with spleen-kidney yang deficiency diarrhea

CHEN Zhi-min， HU Chang-jiang*， PAN Xin， ZHAO Ling， XIONG Rui， GENG Yuan-yuan，HU Lin
（College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China）

AIMTo compare the effects of after and before processing of Buguzhi（Psoraleae Fructus）and Roudoukou（Myristicae Semen）which comprised Ershen Pills on rats with spleen-kidney yang deficiency diarrhea from the viewpoint of energeticmetabolism.METHODSThe ratsmodels for the spleen-kidney yang deficiency diarrheaweremade through the perfusion of adenine，irregular diet，and reception of ice senna extract.Themodels were treated with Ershen Pills.The activity of Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase and lactate dehydrogenase（LDH）in the liver tissue weremeasured by enzyme-linked immunosorbantassay.And the activity of succinate dehydrogenase（SDH）was observed by the colorimetric method.RESULTSIn comparison to the normal control group，processed Buguzhi and Roudoukou expressed a lower level of Na+-K+-ATPase（P＜0.01），Ca2+-Mg2+-ATPase（P＜0.01）and SDH（P＜0.01），and a higher level of LDH（P＜0.01）in model group.Compared with themodel group，the Ershen PillsⅣgroup could enhance the level of Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase and SDH activity，decrease the level of LDH activity.There were extremely significant differences（P＜0.01）. The Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase and SDH activity in Ershen PillsⅣgroup were higher than those in Ershen PillsⅠgroup，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The LDH activity in Ershen PillsⅣgroup was lower than that in Ershen PillsⅠgroup，the difference was also statistically significant（P＜0.05）.CONCLUSIONErshen Pills，consisting of salt-frying Buguzhiand bran-roasting Roudoukou，has the function of improving the energetic metabolism of rats with spleen-kidney yang deficiency diarrhea，which may be related to relevant enzymes.

Ershen Pills；Buguzhi（Psoraleae Fructus）；Roudoukou（Myristicae Semen）；processing；energetic metabolism；ATP；SDH；LDH

R283.1

：A

：1001-1528（2015）06-1298-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.030

2014-07-10

國家自然科學基金面上項目 （81274085）

陳志敏 （1990—），碩士生，主要從事中藥炮制與制劑研究。Tel：15281087650，E-mail：346578767@qq.com。

*通信作者：胡昌江 （1952—），教授，博士生導師，主要從事中藥炮制學的教學和科研。Tel：13980980796，E-mail：hhccjj@hotmail.com