菊杞保肝膠囊對大鼠亞急性酒精性肝損傷的保護作用及其機理

杜麗萍， 康 永， 郝旭亮， 劉 聰， 岳永花

（山西省中醫藥研究院，山西太原030012）

［科研報道］

菊杞保肝膠囊對大鼠亞急性酒精性肝損傷的保護作用及其機理

杜麗萍， 康 永， 郝旭亮， 劉 聰， 岳永花*

（山西省中醫藥研究院，山西太原030012）

目的觀察菊杞保肝膠囊對大鼠亞急性酒精性肝損傷的防治作用及作用機理。方法取SPF清潔級SD大鼠60只，隨機分為6組，分別為空白組、模型組、對照藥 （葵花護肝片）組、菊杞保肝膠囊低、中、高劑量 （0.23、0.46、0.92 kg/g）組，建立大鼠亞急性酒精性肝損傷模型，菊杞保肝膠囊各組及對照藥水溶液灌胃，給藥30 d后，檢測大鼠血清中膽固醇 （CHO）、甘油三酯 （TG）、低密度脂蛋白膽固醇 （LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇 （HDL-C）、膽紅素 （TBIL）、丙氨酸氨基轉移酶 （ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶 （AST）及超氧化物歧化酶 （SOD）活性和丙二醛（MDA）水平；ELISA檢測血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、前列腺素E2（PGE2）、白介素-6（IL-6）的水平；RTPCR檢測COX-2 mRNA的表達及肝組織病理觀察。結果與模型組比較，菊杞保肝膠囊各劑量組大鼠血清中CHO、TG、LDL-C、ALT、AST、PGE2、TNF-α、IL-6水平降低，COX-2表達下調，HDL-C水平升高（P＜0.05或P＜0.01），并可顯著升高中、高劑量組大鼠血清中SOD活性，降低MDA水平 （P＜0.05或P＜0.01）。病理結果顯示菊杞保肝膠囊各劑量能改善模型大鼠的肝臟組織病理損傷。結論菊杞保肝膠囊對大鼠亞急性酒精性肝損傷具有保護作用，其作用機理可能與降低血清中PGE2，TNF-α及IL-6量及下調肝組織COX-2的表達及抗氧化應激有關。

菊杞保肝膠囊；亞急性酒精性肝損傷；大鼠；血脂；肝功

目前我國由大量酗酒所致的肝損傷呈逐年上升趨勢，為僅次于病毒性肝炎的第二大肝?。?］。酒精性肝損傷是以肝臟脂肪變性、炎性細胞浸潤，甚至纖維化為特征的一種長期慢性中毒性肝臟疾?。?］，其主要臨床特征是惡心嘔吐、黃疸、肝臟腫大和壓痛，進一步可并發肝功能衰竭和上消化道出血等［3］。菊杞保肝膠囊為我院的臨床經驗方，由澤瀉、葛根、菊花、枸杞子等藥材組成，在治療酒精性肝病效果顯著，毒副作用少，且低成本、高效率、具有開發價值。本實驗就菊杞保肝膠囊對亞急性酒精性肝損傷大鼠的保肝作用進行研究探討。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 60只健康SD大鼠，雌性未孕，體質量（220±20）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2009-0004。清潔恒溫環境，飼料由醫科院動物研究所提供，適應性喂養1周開始實驗。

1.2 實驗儀器 科大創新股份有限公司KDC-2046低速冷凍離心機；北京普析通用儀器有限責任公司TU-1901雙光束紫外可見分光光度計；日本三洋公司醫用冷凍冰箱；美國BioTeK公司全自動酶標儀，多功能微孔讀板儀；LEICA RM2125石蠟切片機；日本Olympus PM.10AD光學顯微鏡；日本株式會社尼康Nikon尼康光鏡顯微照相機；美國Agilent StratagenePCR儀；全自動生化分析儀OLYMPUS-AU640。

1.3 試劑和材料 菊杞保肝膠囊為自制，批號130705。由菊花、枸杞子、丹參、山楂、黃精、葛根等十味藥材組成。加水煎煮2次，每次1 h，合并濾液，濃縮，干燥，得到干膏，出膏率31.56%，干膏為棕褐色，氣微辛、味苦。大鼠每日給藥量5.1 g/kg（相當于生藥量15 g）。52%二鍋頭（北京二鍋頭酒業股份有限公司，批號043005）。葵花護肝片 （黑龍江葵花藥業股份有限公司，批號201309004）。CHO、TG、HDL-C、LDL-C試劑盒均購自北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號分別為：20130115、20130112、20130717、20130401?？偰懠t素測試盒、MDA測試盒、SOD測試盒，均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20130816、20130911、20130916。PGE2、TNF-α、IL-6試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，批號分別為1310283、1310318、130325。RT-PCR試劑盒購自上海生工公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2 方法

2.1 動物模型建立 50只SD大鼠，每天灌胃給予52%二鍋頭10mL/kg，每天1次，連續4周，復制亞急性酒精性肝損傷大鼠模型［4］。

2.2 動物分組與給藥 （受試藥物灌胃后間隔2 h以上再給予52%二鍋頭） 將50只SD大鼠隨機分為5組即模型組、陽性對照組 （葵花護肝片，0.525 g/kg），菊杞保肝膠囊低劑量組（0.23 g/kg）、中劑量組（0.46 g/kg）、高劑量組 （0.92 g/kg），每組10只。另取10只大鼠為空白組。各組大鼠分別灌胃給予上述劑量的受試藥物；空白組和模型組給予相同劑量的蒸餾水。給藥體積為1 mL/100 g，連續30 d，每周稱定體質量一次，調整給藥劑量。

2.3 指標檢測及方法

2.3.1 一般情況觀察 觀察實驗過程中各組動物的一般情況，包括精神、活動狀況、飲食、排便、皮毛等，每周測1次體質量，觀察大鼠的體質量變化情況。末次給藥后8 h，稱體質量，10%水合氯醛 （0.3 mL/100 g）麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min離心，15 min，取上清液制備血清，-20℃保存待檢；分離肝臟組織，稱定，左葉置于10%福爾馬林中固定，右葉迅速放置于液氮中冷凍保存。

2.3.2 肝臟指數 肝臟指數（%）=肝臟質量 （g）/體質量 （g）×100%。

2.3.3 指標檢測方法 檢測大鼠血脂、肝功及血清中SOD、MDA的水平，總膽紅素 （TBIL）、血清膽固醇（CHO）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、甘油三酯 （TG）檢測均按試劑盒說明書進行檢測；采用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶 （ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）；化學比色法檢測大鼠血清中丙二醛 （MDA）、超氧化物歧化酶 （SOD）的水平。

2.3.4 血清PGE2，TNF-α及IL-6的測定 采用酶聯免疫吸附試驗 （ELISA）法測定，按試劑盒說明書進行。

2.3.5 COX-2 mRNA的表達 實時熒光定量PCR檢測環氧-2（COX-2）mRNA的表達，用TRIZOL法提取總RNA，在紫外分光光度計中測OD260、OD280值，計算RNA濃度和含量，OD260/OD280在1.8～2.0，RNA的純度符合實驗要求；檢測RNA的完整性后采用逆轉錄系統試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA；特異性引物分別擴增COX-2、β-actin。引物序列（5cy3c）：COX-2正向引物為CTG TAT CCC GCC CTG CTG GT；反向引物為GAG GCA CTTGCG TTG ATG GT［5］。產物210 bp。β-actin（內參照）正向引物為GATGGTGGG TATGGG TCA GAA；反向引物為CTA GGA GCC AGG GCA GTA ATC，產物332 bp（均由上海生工公司合成）。反應條件：94℃預變性3 min，然后按94℃，30 s，50℃，30 s，72℃，1 min進行28個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物在瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠（EB）染色，凝膠成像儀照相記錄。用Quantity One 4.0圖像分析軟件分析。

2.3.6 肝臟組織病理學檢查 用10%福爾馬林液中固定肝組織標本，48 h后常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察。

2.4 統計學處理 所有實驗數據以均值±標準差 （x±s）表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理，組間比較采用方差分析及LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 一般情況 實驗期間，模型組有2只大鼠、葵花護肝片組1只大鼠、菊杞保肝膠囊中劑量組1只大鼠酒精灌胃誤入氣管死亡，其余全部存活。模型組與空白組比較其皮毛無光澤，有脫毛現象，體質量減輕，嗜睡，且反應遲鈍，個別大鼠有被咬傷。中低劑量組相對模型組大鼠，偶有脫毛，進食增多，活動相對較多，食欲和整體狀態較好。高劑量組與空白組對比狀態相近，無死傷。

3.2 菊杞保肝膠囊對各組大鼠體質量和肝臟指數的影響

與空白組相比，模型組大鼠體質量無明顯變化 （P＞0.05），但肝臟指數增加 （P＜0.05），與模型組相比，菊杞保肝膠囊各劑量組和葵花護肝片組大鼠體質量無統計學意義 （P＞0.05），而高劑量組和葵花護肝片組大鼠肝臟指數減小，與模型組相比具有統計學意義 （P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠體質量和肝臟指數的變化 （x±s）

3.3 菊杞保肝膠囊對各組大鼠血脂的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清中CHO、TG、LDL-C水平均顯著升高，HDL-C水平降低（P＜0.01），表明模型復制成功。與模型組相比，菊杞保肝膠囊各劑量組大鼠血清中CHO、TG、LDL-C水平降低（P＜0.01或P＜0.05）；HDL-C均升高 （P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠血清TBIL、CHO、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST水平（x±s）

3.4 菊杞保肝膠囊對各組大鼠肝功能的影響 血清ALT，AST模型組與正常組比較均升高，具有統計學意義 （P＜ 0.01）；菊杞保肝膠囊各組與模型組比較血清ALT，AST有下降，與模型組相比具有統計學意義 （P＜0.01或P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠血清中ALT、AST水平（x±s）

3.5 菊杞保肝膠囊對各組大鼠血清中SOD、MDA的影響

模型組大鼠血清中SOD水平降低、MDA水平升高，與正常組相比具有統計學意義 （P＜0.01）；菊杞保肝膠囊中、高劑量組SOD水平均升高，與模型組相比具有統計學意義（P＜0.01）；中、高劑量組MDA水平降低，與模型組相比具有統計學意義 （P＜0.01或P＜0.05）；陽性組 （葵花護肝片組）SOD水平較升高，與模型組相比具有統計學意義（P＜0.01），而MDA水平有所降低，與模型組相比具有統計學意義 （P＜0.05），見表4。#P＜0.05，##P＜0.01

表4 各組大鼠血清中SOD、MDA水平（x±s）

3.6 菊杞保肝膠囊對各組大鼠血清PGE2、TNF-α及IL-6的影響 由表5所見模型組血清PGE2，TNF-α及IL-6均升高，與正常組相比具有統計學意義 （P＜0.01）；菊杞保肝膠囊各組血清PGE2，TNF-α及IL-6均下降，與模型組相比具有統計學意義 （P＜0.05）。結果表明菊杞保肝膠囊具有減少炎癥介質PGE2，TNF-α及IL-6作用，見表5。

表5 各組大鼠血清PGE2，TNF-α及IL-6水平（x±s）

3.7 菊杞保肝膠囊對各組大鼠肝組織COX-2mRNA表達

正常對照組表達弱，模型組呈高表達，與對照組相比具有統計學意義 （P＜0.01），見圖1。菊杞保肝膠囊高劑量組COX-2 mRNA表達下調，與模型組相比具有統計學意義（P＜0.01），F=27.94。經計算機Bandscan軟件分析其灰度值，COX-2mRNA灰度值與β-actin灰度值比值為：對照組 （n=7）為0.196±0.079，模型組 （n=7）為0.421± 0.033，菊杞保肝膠囊高劑量組 （n=6）為0.281±0.046。

圖1 各組COX-2 mRNA在肝組織中的表達

3.8 菊杞保肝膠囊對各組大鼠肝臟形態學變化及病理學檢查 肉眼觀察空白大鼠肝臟被膜光滑，明亮有光澤，呈紅褐色。模型組較空白組大鼠肝臟體積明顯增大，包膜緊張，邊緣圓鈍，部分肝臟呈奶黃色，切面油膩，無光澤，與周圍組織有黏連。與模型組比較，菊杞保肝膠囊各組大鼠介于正常組與模型之間，肝臟顏色紅潤，被膜較光滑，切面無明顯油膩感，無局灶黃白色變性灶，質地接近正常肝組織。肝組織病理學觀察，光鏡下由圖可見，空白組大鼠肝臟中央靜脈周圍肝細胞體積未見增大，胞漿致密，肝竇未見異常；與空白組相比，模型組中央靜脈肝細胞體積明顯增大，胞漿疏松肝竇受壓變窄，并可見大量的紅染物質，匯管區可見大量炎細胞浸潤；菊杞保肝膠囊高、中、低組肝細胞體積、胞漿疏松程度顯著減小，肝竇受壓程度降低，部分肝細胞存在脂肪變及核固縮。見圖2。

4 討論

亞急性酒精性肝損傷是人類常見的肝病之一，在我國日益增多，早期癥狀通常表現為脂肪肝，進而發展為酒精性肝炎，后期酒精性肝纖維化和肝硬化，因此肝損傷早期的預防及治療尤為重要。菊杞保肝膠囊源于我院臨床經驗方，由枸杞、菊花、葛根等十余種藥味組成，臨床表明其具有解毒保肝的功效，但其作用機理尚未明確。

ALT、AST作為肝細胞內轉氨酶，在氨基酸的合成與分解代謝中起重要作用。在正常情況下活性低，只有極少量釋放入血液中。當肝組織受到急性損傷或細胞膜通透性增加時，這兩種酶活性顯著增高。當肝功能受損時脂類代謝發生紊亂，從而導致血脂濃度發生改變，肝病患者肝細胞腫脹、變性、壞死，使體內激素代謝發生變化，影響脂類代謝，是反映肝實質性損傷的一個重要指標［6］。現代研究指出，LDL-C、HDL-C測定可作為肝功能的輔助參考指標［7］。本實驗模型組與空白組比較，血清中ALT和AST均明顯升高，CHO、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，表明大鼠攝入52%北京二鍋頭可成功建立亞急性酒精性肝損傷大鼠模型。經杞菊保肝膠囊給藥30 d后，與模型組比較，各給藥組大鼠血清中ALT、AST、CHO、TG、LDL-C水平均顯著降低，HDL-C水平顯著升高，表明杞菊保肝膠囊可改善酒精對肝組織的損傷作用。

圖2 各組大鼠酒精肝模型肝組織病理學觀察 （×200）

SOD活性反映了機體清除氧自由基的能力，MDA的高低反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。機體自身有一套抗氧化防御系統，不斷清除新產生的自由基，當機體SOD活性下降、MDA水平增高時，該防御系統作用減弱或受損，就會誘發或加重疾?。?］。實驗結果表明菊杞保肝膠囊中、高劑量均能降低大鼠血清MDA水平，升高SOD活性，菊杞保肝膠囊高劑量組對血清MDA水平影響要優于各組。

酒精性肝炎發病中有免疫因素參與，如分離的酒精透明小體和自身肝抗原，可刺激體內淋巴細胞轉化和游走移動抑制免疫因子活力。有些細胞因子如白細胞介素 （IL）、腫瘤壞死因子（TNF）、前列腺素E2（PGE2）等與酒精性肝炎的發生有關。菊杞保肝膠囊各組與模型組比較，血清PGE2、TNF-α及IL-6明顯下降，差別均有顯著性意義，菊杞保肝膠囊具有減少炎癥介質PGE2、TNF-α及IL-6作用。

環氧合酶-2（COX-2）又稱前列腺素合成酶，是前列腺素合成過程中的限速酶，正常情況下在大部分組織中不表達或極低表達，而主要表達在單核細胞、血管內皮細胞、巨噬細胞等與炎癥有密切關系的細胞或組織中；在炎癥因子或細胞因子受到各種刺激的情況下可誘導表達，參與和加重炎癥反應，在炎癥及組織損傷、腫瘤的發生發展過程中表達增高［9-11］。本實驗結果顯示正常大鼠肝組織中COX-2呈極低表達，模型組中COX-2表達明顯增高，使用菊杞保肝膠囊后各組COX-2表達與模型組相比有明顯降低。提示菊杞保肝膠囊各組在急性肝損傷中起著一定的保護作用，由于COX-2及其產物PGs體系本身的復雜性，現有的結果對于其在肝損傷方面的作用機制解釋尚不夠完善，有關亞急性酒精性肝損傷發生發展中炎癥通路的作用及確切機制仍有待進一步探討。

上述實驗結果表明，在酒精性肝損傷過程中，逐漸出現脂代謝紊亂和肝功異常，菊杞保肝膠囊可改善脂質代謝紊亂，抑制肝組織損傷；長期大量酒精可刺激肝組織化學性炎癥介質PGE2、TNF-α及IL-6的釋放，促進肝組織COX-2的表達，而菊杞保肝膠囊可以拮抗上述變化，從而減輕酒精導致的肝組織損傷。

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R285.5

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：1001-1528（2015）06-1325-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.037

2014-07-15

杜麗萍，女，碩士生，研究方向為中藥藥理。Tel：（0351）2486811，E-mail：297957178@qq.com