麝香保心丸對心力衰竭大鼠心肌重構及縫隙連接蛋白Cx43和Cx45的影響

吳志雄， 江振濤， 羅 健， 周松柏， 肖 婷， 李 芳， 楊 軍

（南華大學附屬第一醫院心血管內科，湖南衡陽421001）

麝香保心丸對心力衰竭大鼠心肌重構及縫隙連接蛋白Cx43和Cx45的影響

吳志雄， 江振濤， 羅 健， 周松柏， 肖 婷， 李 芳， 楊 軍*

（南華大學附屬第一醫院心血管內科，湖南衡陽421001）

目的觀察麝香保心丸（Shexiang Baoxin Pills，SBP）對壓力超負荷所致心力衰竭大鼠的心肌重構及縫隙連接蛋白Cx43和Cx45表達的影響。方法取雄性SD大鼠30只，隨機分為假手術組 （SO組）、心力衰竭模型組 （HF組）、心力衰竭模型+麝香保心丸組 （HS組），各10只。采用腹主動脈縮窄法建立大鼠心力衰竭模型，HS組以麝香保心丸 （15mg/kg，1天2次）灌胃，而HF組和SO組則用生理鹽水替代。12周后進行心臟B超檢查，處死大鼠，取出左心室肌組織，HE染色觀察心肌形態結構，Western blot檢測Cx43和Cx45在左室心肌組織的表達。結果心臟B超顯示，與SO組比較，HF組左室舒張末內徑顯著增加，EF（射血分數）值下降；HS組左室舒張末內徑減少，EF值增加。HE染色顯示，HS組與HF組相比，心肌細胞排列紊亂明顯改善；Western blot顯示，HF組Cx43表達明顯減少，但Cx45表達沒有明顯變化；HS組Cx43表達明顯上調。結論SBP可以改善心力衰竭大鼠的心肌重構，改善縫隙連接蛋白Cx43表達的下調。

麝香保心丸；心肌細胞；Cx43；Cx45；心肌重構

心力衰竭是大多數心血管疾病的終末期表現和主要死因。心肌重構是心力衰竭發生發展的基本病理機制，心肌重構不僅引起心功能障礙，而且是各種心律失常發生的基質，所以心力衰竭時更容易并發心律失常和猝死。縫隙連接重構不僅與心力衰竭時的結構重構密切相關，也是心力衰竭時電生理重構的重要組成部分。縫隙連接 （gap junc-tion，GJ）是相鄰心肌細胞間電化學偶聯的通道，其中Cx43是心室肌表達的最主要縫隙連接蛋白 （Connexin，Cx）［1］，而心室肌內同時還存在Cx45。縫隙連接蛋白表達的異常可能影響縫隙連接電荷耦聯和代謝耦聯的功能導致心律失常的發生。麝香保心丸已證實具有擴張冠狀動脈、保護血管內皮細胞、促進血管新生及抗心肌纖維化等作用［2］。臨床上也發現麝香保心丸對早搏、房顫、慢性心律失常也具有一定的療效［3］，但是針對其作用機制目前少有研究，而麝香保心丸與縫隙連接重構關系目前尚不清楚。本實驗擬通過腹主動脈縮窄大鼠模型觀察麝香保心丸對壓力超負荷所致心力衰竭時心肌重構及心室肌縫隙連接重構的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實驗試劑及儀器 麝香保心丸由上海和黃藥業提供；Cx43一抗、DAD顯色試劑盒、免疫組化染色試劑盒均購于博士德公司；HE染色試劑盒購于北京碧云天生物技術公司；石蠟切片機、烤片機、自動脫水機均購于德國Leica公司；-80℃低溫冰箱購于日本SANYO公司；冷凍離心機購于德國Eppendorf公司；心臟彩色B超機購于美國GE公司；垂直電泳儀器及轉膜系統為中國北京六一儀器廠生產。

1.2 實驗大鼠 成年雄性SD大鼠（Sprague-Dawley）30只，體質量200～250 g，南華大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK（湘）2010-0006。

1.3 壓力超負荷心力衰竭模型的制備 將實驗大鼠隨機分為假手術組 （SO組），心力衰竭模型組 （HF組）、心力衰竭模型+麝香保心丸組 （HS組），每組10只，均用10%的水合氯醛 （3 mL/kg）腹腔注射麻醉，固定，備皮，常規消毒后，沿腹正中線作一長約2 cm切口，分離組織，打開腹腔，HF組和HS組大鼠在腎動脈上方找到腹主動脈，然后用4號手術縫線將一個直徑為0.7 mm的針頭與腹主動脈一起結扎，隨后取出該鋼針，從而形成腹主動脈縮窄，驗證腹主動脈通暢后，注入慶大霉素注射液預防感染，快速分層縫合關閉腹腔［4］。SO組大鼠除了不縮窄腹主動脈外其余步驟完全與上述相同。HS組通過灌胃的方法每天給予SBP 15 mg/kg（溶于雙蒸水2 mL）灌胃2次，而SO組和HF組則用自來水灌胃［5］。常規喂養12周。

1.4 超聲檢測心動圖 麝香保心丸干預12周后，麻醉大鼠，固定，剃胸前區毛，取仰臥位，由有經驗的心臟超聲醫生用彩色多普勒超聲診斷儀盲法測量，測量左室收縮期內徑（Left ventricular systolic diameter，LVIDs），左室舒張期內徑（Left ventricular diastolic diameter，LVIDd），射血分數（Ejection fraction，EF）。

1.5 HE心肌組織染色觀察形態結構變化 處死大鼠后，縱向切取小塊左心室心肌組織，置10%中性甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋、切片，HE染色，最后樹膠封片。鏡下觀察：細胞核深藍色，胞漿及纖維組織呈深淺不等的紅色。

1.6 Western blot測定麝香保心丸對心衰模型大鼠心肌Cx43和Cx45表達的影響 取小塊左心室心肌組織剪成100 mg左右大小組織塊，用于提取蛋白。以BCA蛋白定量試劑盒定量各組蛋白濃度。采用10%SDS-PAGE凝膠電泳，充分分離目的蛋白；將目的蛋白轉移至PVDF膜上；將膜置于封閉液中于室溫下搖床孵育2 h。封閉結束后，分別孵育兔抗大鼠Cx43和Cx45多克隆抗體 （1∶1 000），4℃過夜。TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，以封閉液稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶2 000），室溫搖動孵育1 h。TBST緩沖液洗膜。將DAD顯色試劑盒中的A和B兩種試劑在避光的離心管中等體積混勻1 min，將此混合液均勻圖于膜蛋白上，置于顯影儀上曝光顯影。

1.7 統計學分析 全部數據使用SPSS 18.0軟件及EXCEL分析，計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析，檢驗方差齊性，方差齊性的兩兩進行組間比較，P＜0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物情況 造模過程中，假手術組和心力衰竭組各死亡1只，可能死于麻醉意外和手術大出血。28只大鼠完成實驗，其中SO組9只，HF組9只，HS組10只。

2.2 建模12周后各組大鼠的左室內徑及EF值測量結果

與SO組相比，HF組和HS組大鼠心臟左室收縮期內徑LVIDs，左室舒張期內徑LVIDd明顯增大，EF值下降均小于50%，與HF組相比，HS組大鼠心臟左室收縮期內徑LVIDs和左室舒張期內徑LVIDd減少，EF值增加，兩組間差異具有統計學意義 （P＜0.05），結果見表1和圖1。

表1 麝香保心丸對腹主動脈縮窄SD大鼠心臟B超參數的影響 （x±s）

2.3 HE染色觀察麝香保心丸對心力衰竭大鼠心肌組織形態結構變化的影響 圖2中HE染色顯示SO組心肌纖維結構清晰，心肌細胞排列規則；HF組心肌細胞排列紊亂，心肌細胞肥大，心肌細胞間隙增寬，間質可見纖維化；而用麝香保心丸干預的HS組，心肌細胞排列較規則，大部分心肌纖維呈平行排列，結構清晰，間質有少量疏松結締組織。

2.4 麝香保心丸對心力衰竭大鼠心肌組織Cx43和Cx45表達的影響 Western blot結果顯示：與SO組比較，HF組Cx43的表達顯著減少 （P＜0.05）；與HF組比較，HS組Cx43的表達顯著增加，SBP能夠明顯抑制心衰大鼠心肌Cx43表達的下調 （P＜0.05），見圖3；與SO組比較，HF組Cx45的表達未明顯變化 （P＞0.05）；而與HF組比較，HS組Cx45的表達也無明顯改變 （P＞0.05），見圖4。

圖1 各組大鼠M型超聲心動圖結構參數變化

圖2 心肌組織病理形態學改變

圖3 SBP對心力衰竭大鼠心肌細胞Cx43表達的影響

圖4 SBP對心力衰竭大鼠心肌細胞Cx45表達的影響

3 討論

心力衰竭是大多數心血管疾病的終末期表現及主要死亡原因，正在成為本世紀最重要的心血管疾病，而心肌重構是心力衰竭發生發展的基本病理機制。心肌重構的病理主要表現包括心肌細胞肥大和凋亡，以及胞外基質纖維化。人們已發現心力衰竭時更容易并發心律失常和心源性猝死，而這與心肌重構時伴隨的電生理重構有關。電生理重構包括離子通道重構和縫隙連接［6］。心力衰竭時發生的縫隙連接重構與心肌結構重構密切相關，故開發能同時逆轉心肌結構重構及縫隙連接重構的藥物，對治療心力衰竭以及其合并的心律失常有著重要價值。

縫隙連接由縫隙連接蛋白組成，在心室肌細胞中主要有Cx43、Cx45、Cx40表達，其中Cx43是心室的主要縫隙連接蛋白。縫隙連接蛋白的表達異常，可導致細胞間電化學偶聯的異常，從而可促使心律失常發生。Gutstein等［7］發現解剖Cx43基因剔除的純合子鼠均因自發性室性心律失常而猝死。Hall等在擴張性心肌病幼鼠模型中發現在射血分數明顯下降和明顯左室重構之前就出現了Cx43表達的下調。提示Cx43的重構在心力衰竭的早期即可出現，同時在心力衰竭不同階段可能存在表達差異［8］。本研究中發現腹主動脈縮窄構建的心力衰竭大鼠心臟左室組織中的Cx43表達明顯的下調，但Cx45表達未發生明顯變化。

麝香保心丸在臨床中主要用于冠心病的治療，但近些年來有研究發現麝香保心丸對心衰治療有效。在老年退行性心瓣膜病并發左心衰竭患者中，給予常規治療同時加服麝香保心丸，患者心功能較常規治療組明顯改善［9］；在心肌梗死后心力衰竭患者也得到類似結果［10］，但其中機制不明確。本實驗發現，麝香保心丸可降低大鼠左室舒張期內徑LVIDd，增加EF值，同時觀察心肌超微結構發現與正常大鼠相比，心力衰竭大鼠心肌細胞排列紊亂，而麝香保心丸組心肌細胞排列紊亂明顯改善，提示麝香保心丸麝香保心丸可以改善心功能，其機制可能與其逆轉心力衰竭時的心肌重構有關。已有多個臨床觀察研究發現麝香保心丸對早搏、房顫、慢性心律失常都有一定的療效，但麝香保心丸減少心律失常的機制少有研究，與縫隙連接重構的關系也未見報導。本實驗發現心力衰竭大鼠心肌Cx43表達明顯下調，而麝香保心丸可以上調心力衰竭大鼠心肌Cx43的表達，但對心肌Cx45表達沒有明顯影響。縫隙連接重構與心律失常的發生和心肌結構重構均有關，麝香保心丸可能具有通過抑制負性心肌重塑改善心力衰竭時心肌的縫隙連接重構從而減少心律失常的發生。該實驗結果為探討中藥的抗心律失常的機制提供了新的思路。

［1］Itoh M，Takeishi Y，Nakada S，et al.Long-term treatmentwith angiotensin II type 1 receptor antagonist，CV-11974，restores beta-catenin mRNA expression in volume-overloaded rabbit hearts［J］.Heart Vessels，2002，17（1）：36-41.

［2］黃紅漫，許其倓.麝香保心丸對慢性心力衰竭患者內皮功能及心功能的影響［J］.中成藥，2004，26（Z1）：41-43.

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［4］高 妍，高建平.心力衰竭動物模型的研究進展［J］.中成藥，2014，36（01）：148-152.

［5］王大英，李 勇，范維琥.麝香保心丸對心肌梗死大鼠梗死面積和血管新生的作用［J］.中成藥，2004，26（11）：912-915.

［6］Van Rijen H V，Eckardt D，Degen J，et al.Slow conduction and enhanced anisotropy increase the propensity for ventricular tachyarrhythmias in adultmicewith induced deletion of connexin43［J］.Circulation，2004，109（8）：1048-1055.

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［10］楊國亮，楊錫珍，劉建輝，等.麝香保心丸對急性心肌梗死后左室重構及心功能影響的超聲觀察［J］.河南中醫，2014，34（1）：58-59.

R285.5

：B

：1001-1528（2015）06-1329-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.038

2014-08-18

國家自然科學基金項目 （81270181）；湖南省自然科學基金項目 （11JJ2046）

吳志雄 （1988—），男，碩士，從事心血管疾病研究。Tel：15211803302，E-mail：455247958@qq.com

*通信作者：楊 軍（1972—），男，博士，副教授，副主任醫師，從事心血管疾病研究。E-mail：yangjunincn@163.com