柿葉乙酸乙酯部位急性毒性及其對S180荷瘤小鼠的影響

陳 麗， 羅 宇， 梁宇紅， 馬新博， 韋 敏， 陳 君*

（1.廣西科技大學醫(yī)學院，廣西柳州545005；2.柳州市工人醫(yī)院，廣西柳州545005；3.柳州市人民醫(yī)院，廣西柳州545006）

柿葉乙酸乙酯部位急性毒性及其對S180荷瘤小鼠的影響

陳 麗1， 羅 宇1， 梁宇紅2， 馬新博1， 韋 敏3， 陳 君1*

（1.廣西科技大學醫(yī)學院，廣西柳州545005；2.柳州市工人醫(yī)院，廣西柳州545005；3.柳州市人民醫(yī)院，廣西柳州545006）

目的研究柿葉乙酸乙酯部位對正常小鼠急性毒性試驗和對S180荷瘤小鼠的影響。方法在急性毒性試驗的基礎上，建立S180荷瘤小鼠模型。將荷瘤小鼠隨機分為柿葉乙酸乙酯部位高、中、低劑量組，模型組和環(huán)磷酰胺組。給藥10 d后觀察小鼠的腫瘤生長情況，計算抑瘤率、生命延長率、胸腺系數、脾臟系數、肝臟系數，瘤組織做病理切片。結果小鼠一次灌胃柿葉乙酸乙酯部位最大給藥量不小于生藥589.82 g/kg。環(huán)磷酰胺及柿葉乙酸乙酯部位高、中、低劑量對S180荷瘤小鼠抑瘤率分別為73.47%、37.91%、27.22%、11.02%。生命延長率分別為54.91%、36.99%、22.54%、8.09%。柿葉乙酸乙酯部位高、中、低劑量組的胸腺系數 ［（2.91±0.38）mg/g、（2.82±0.31）mg/g、（2.64±0.20）mg/g］和脾臟系數［（8.49±0.36）mg/g、（8.11±0.48）mg/g、（8.03±0.42）mg/g］均明顯比模型組［（2.20±0.36）mg/g、（7.42±0.92）mg/g］和環(huán)磷酰胺組［（1.94±0.24）mg/g、（6.81±0.52）mg/g］高 （P＜0.01）。柿葉乙酸乙酯部位高、中、低劑量組的肝臟系數 ［（49.24±6.33）mg/g、（51.17±4.88）mg/g、（55.59±8.74）mg/g］比模型組（62.19±8.10）mg/g和環(huán)磷酰胺組（69.19±9.50）mg/g低（P＜0.01或P＜0.05）。用藥組腫瘤組織HE染色后，均可見不同程度的壞死灶，其中柿葉乙酸乙酯部位高劑量組壞死面積最大。結論柿葉乙酸乙酯部位毒性低，能抑制S180荷瘤小鼠腫瘤增殖。

柿葉；乙酸乙酯部位；肉瘤S180小鼠；抗腫瘤作用；急性毒性

柿葉為柿樹科Ebenaceae柿樹屬Diospyros植物柿Diospyros kaki L.f.的新鮮或干燥葉。柿葉具有抗菌消炎、生津止渴、清熱解毒、潤肺強心、鎮(zhèn)咳止血、抗癌防癌等多種醫(yī)療保健功能。已有報道，柿葉水、醇提取物作用于體外H22細胞和H22、S180荷瘤小鼠，有明顯的抑瘤效應［1-3］；柿葉黃酮能明顯抑制由TNF-α誘導的大鼠血管平滑肌細胞凋亡信號調節(jié)激酶1蛋白的表達［4］，并對人肝癌SMMC-7721細胞的形態(tài)有一定的誘變作用及一定的抑制增殖作用［5］。柿葉主要有效成分黃酮類化合物存在于其乙酸乙酯部位，故本研究以S180荷瘤小鼠為研究對象，對柿葉乙酸乙酯部位體內抗腫瘤作用進行初步研究，為進一步開發(fā)利用柿葉提供一定的實驗依據。

1 材料

1.1 藥品與試劑 柿葉 （購自廣西柳州市城站藥材綜合市場，經中國科學院廣西植物研究所韋發(fā)南研究員鑒定為真品）；柿葉乙酸乙酯部位由實驗室自行制備：柿葉粗粉500 g用70%乙醇回流提取2次，合并濾液，濾液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮后用乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮干燥，研碎得乙酸乙酯萃取部位13.75 g，用時以吐溫80為增溶劑，加蒸餾水適量即得不同質量濃度的受試物，現用現配；空白溶劑：由0.5 mL吐溫80與50 mL蒸餾水混勻即得；環(huán)磷酰胺（陜西普德藥業(yè)股份有限公司，批號：04120703）。

1.2 儀器 RE-52旋轉式蒸發(fā)器 （上海安亭實驗儀器有限公司）；BSC-1300ⅡA2生物安全柜 （上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；TS-12F生物組織自動脫水機 （孝感市電子儀器廠）；NP-B型生物組織包埋機 （孝感市諾普電子科技有限公司）；RM2235組織切片機 （德國徠卡）；NP-P型生物組織攤片烤片機 （孝感市諾普電子科技有限公司）；BX-53顯微鏡（日本Olympus公司）；SB-3200DTDN超聲波清洗機 （寧波新芝生物科技股份有限公司）；移液器 （賽默飛世爾儀器有限公司）。

1.3 動物 健康昆明種小鼠120只，雌雄各半，體質量18～22 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供 （許可證號：SCXK桂2009-0002）；S180肉瘤荷瘤小鼠購自廣西中醫(yī)藥研究院。

2 方法

2.1 急性毒性試驗［6］健康昆明小鼠20只，雌雄各半，隨機分成對照組和給藥組，每組10只，試驗前禁食不禁水12 h。對照組給予空白溶劑。給藥組給予柿葉乙酸乙酯部位，以吐溫80為增溶劑，加適量蒸餾水研磨均勻，配制成剛好能通過16號灌胃針的混懸液，按小鼠灌胃最大容積一次給藥（灌胃容積為0.4 mL/10 g），即16.22 g/kg，相當于生藥589.82 g/kg。給藥后立即觀察小鼠的反應，包括行為活動、大小便、體質量及死亡情況，連續(xù)觀察14 d。試驗結束第15天頸椎脫臼處死小鼠，解剖觀察其心、肝、脾、胃、腎等主要器官的變化。

2.2 柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠的影響 S180腹水小鼠連續(xù)傳代，將接種第7天腹水飽滿的S180荷瘤小鼠以頸椎脫臼法處死，無菌條件下抽取其乳白色腹水，加入生理鹽水使瘤細胞稀釋至1×107個/m L，然后于小鼠右前肢腋窩皮下注射0.2mL/只，接種100只。接種次日，隨機將小鼠分為5組，每組20只，雌雄各半，分別為：模型組、環(huán)磷酰胺組、柿葉乙酸乙酯部位高、中、低劑量組。接種次日給藥，各組用藥情況為：模型組灌胃空白溶劑20mL/kg；環(huán)磷酰胺組灌胃環(huán)磷酰胺100mg/kg；柿葉乙酸乙酯部位按2、1、0.5 g/kg劑量以等體積（0.2 mL）不同濃度灌胃（分別相當于生藥72.73 g/kg、36.36 g/kg、18.18 g/kg）；各組每天用藥1次，連續(xù)10 d，實驗期間每天定量喂飼，次日稱取剩余飼料，計算小鼠每日攝食量，實驗前和實驗結束后稱量小鼠體質量。第11天各組以頸椎脫臼法隨機處死10只小鼠，雌雄各半，剩余小鼠亦停藥并記錄存活天數用以計算生命延長率，存活天數超過30 d的按30 d計［7］。處死的小鼠小心剝離瘤組織、胸腺、肝臟、脾臟，稱重，并計算抑瘤率、胸腺系數、脾臟系數和肝臟系數。將剝離的腫瘤組織HE染色，光學顯微鏡觀察腫瘤組織病理變化并采集圖片。各計算公式為：

表示，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 急性毒性試驗 按小鼠灌胃最大容積給藥后，部分小鼠有惡心、少動現象，約0.5 h后恢復正常。連續(xù)觀察14 d，對照組和給藥組小鼠行為活動、大小便都正常，無小鼠死亡。每7天稱一次體質量，體質量均正常增加，兩組無顯著性差異，結果見表1。第15天處死給藥組小鼠后取其心、肝、脾、胃、腎用肉眼與對照組進行比較，未見組織有異常改變。因此，可認為柿葉乙酸乙酯部位毒性低，小鼠一次灌胃柿葉乙酸乙酯部位的最大給藥量不小于生藥589.82 g/kg。

表1 柿葉乙酸乙酯部位對正常小鼠體質量的影響 （n= 10，x±s）

3.2 柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠體質量和攝食量的影響 從表2可見，給藥期間，環(huán)磷酰胺組小鼠平均攝食量明顯比其他組少，柿葉乙酸乙酯部位各劑量組攝食量明顯高于環(huán)磷酰胺組和模型組 （P＜0.05或P＜0.01）；給藥前各組小鼠體質量無顯著性差異，給藥10 d后柿葉乙酸乙酯部位各劑量組小鼠體質量均比模型組和環(huán)磷酰胺組顯著增加 （P＜0.01），模型組與環(huán)磷酰胺組的體質量無顯著性差異。

表2 給藥期間S180荷瘤小鼠的攝食量和體質量的影響 （x±s，n=20）

3.3 柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠瘤質量、抑瘤率、胸腺系數、脾臟系數和肝臟系數的影響 從表3可見，柿葉乙酸乙酯部位各劑量組均有不同程度的抑瘤效果，其中乙酸乙酯高劑量組效果更為明顯，但低劑量組的瘤質量和模型組無顯著性差異 （P＞0.05），從數據上看，柿葉乙酸乙酯部位對S180小鼠的抑瘤率與劑量具有一定的正相關性；柿葉乙酸乙酯高、中、低劑量組胸腺系數、脾臟系數、肝臟系數與環(huán)磷酰胺組相比較，區(qū)別明顯 （P＜0.05或P＜0.01），但與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），說明環(huán)磷酰胺對胸腺、脾臟、肝臟的毒副作用明顯，而柿葉乙酸乙酯部位對以上臟器無損害。

表3 柿葉乙酸乙酯部位對S180小鼠抑瘤率、胸腺指數、脾臟指數和肝臟指數的影響 （x±s，n=10）

3.4 柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠生命延長率的影響

柿葉乙酸乙酯高、中、低劑量組的荷瘤小鼠生存天數與模型組比較明顯延長 （P＜0.01），柿葉乙酸乙酯低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），柿葉乙酸乙酯部位對S180小鼠的生命延長率與劑量有一定的正相關，結果見表4。

表4 柿葉乙酸乙酯部位對 S180小鼠生命延長率的影響（x±s，n=10）

3.5 腫瘤組織病理學觀察 HE染色可見模型組腫瘤組織排列不規(guī)則，腫瘤細胞較大，核漿比例大，異型性明顯，可觀察到巨核、雙核、奇異核等腫瘤細胞，病理性核分裂象較多；環(huán)磷酰胺組亦可見少量模型組腫瘤細胞的形態(tài)特征，有少量纖維化組織形成，腫瘤組織中可見大片壞死灶，病理性核分裂象很少；柿葉乙酸乙酯部位各劑量組中，高劑量組腫瘤組織中可見明顯片狀的凝固性壞死，壞死面積明顯比中、低劑量組大，可呈一定量效關系，瘤細胞核固縮，大小較為一致，異型性小，壞死主要位于排列松散的細胞間，病理性核分裂象比模型組明顯減少。見圖1。

4 討論

陳壁峰等［8］將柿葉乙醇提取物用于大鼠，發(fā)現有亞慢性毒性和致畸作用；吳睿等［9］對柿葉提取物進行急性毒性及其遺傳毒性研究，結果未見明顯毒性。由柿葉乙酸乙酯部位開發(fā)而成的 “腦心清片”等中成藥已應用于臨床多年［10］，但柿葉乙酸乙酯部位的急性毒性卻鮮有報道。本研究采用經典的最大給藥量試驗對柿葉乙酸乙酯部位進行急毒試驗，給藥后觀察14 d，結果無動物死亡，未能測定出LD50，小鼠體質量均正常增加，與對照組無顯著差異；試驗結束時觀其心、肝、脾、胃、腎，未見病理改變。故可認為柿葉乙酸乙酯部位毒性低，小鼠一次灌胃柿葉乙酸乙酯部位的最大給藥量不小于生藥589.82 g/kg，驗證了前述報道。

圖1 給藥10 d后各組小鼠腫瘤組織病理切片 （×200）

通過提高機體的免疫功能而控制腫瘤的生長、發(fā)展已漸漸成為惡性腫瘤治療的手段之一，中藥對機體的免疫調節(jié)和扶正抗癌作用已越來越受到人們的重視［11］。環(huán)磷酰胺雖有很高的抑瘤作用 （抑瘤率高達73.47%），但其所導致的食欲降低［12］及對免疫器官、代謝器官的影響在不少文獻中有報道［13-14］，本研究亦驗證了環(huán)磷酰胺在這方面的毒副作用。實驗中荷瘤小鼠應用環(huán)磷酰胺后平均攝食量減少，體質量增加不多，并且胸腺和脾臟的質量減少，肝臟質量增加，說明環(huán)磷酰胺可導致小鼠食欲下降，減少S180荷瘤小鼠免疫器官胸腺和脾臟的質量，增加代謝器官肝臟的質量，對免疫器官和代謝器官有一定的毒性。柿葉乙酸乙酯部位不影響小鼠的攝食量和體質量，并能增加S180荷瘤小鼠胸腺和脾臟的質量，減少代謝器官肝臟的質量，從而提高胸腺系數、脾臟系數，降低肝臟系數，說明柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠的免疫和代謝器官具有一定的保護作用，但其對S180荷瘤小鼠的免疫效應需做進一步研究。另外，環(huán)磷酰胺需臨用臨配，因為該藥配成溶液后不穩(wěn)定，應于2～3 h內輸入體內。

生命延長率和抑瘤率是抗腫瘤藥物在藥效學研究方面的重要和基礎性指標，一種藥物是否能夠抗腫瘤首先表現在這兩個方面［15］。本研究表明柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠最長生命延長率為36.99%，可明顯延長荷瘤小鼠的生存時間；柿葉乙酸乙酯部位能顯著減少S180荷瘤小鼠的瘤質量，提高抑瘤率，最大抑瘤率為37.91%。以上研究結果說明柿葉乙酸乙酯部位對S180荷瘤小鼠具有明顯的抗腫瘤作用，并且該部位對S180荷瘤小鼠的生命延長率和抑瘤率與劑量具有一定的正相關性，其量效關系及進一步的機制有待深入研究。

腫瘤組織病理學切片可見，模型組腫瘤組織內壞死細胞較少，腫瘤細胞排列紊亂，核染色深，異形核細胞多見。用藥后腫瘤組織內可見大面積壞死細胞，可見纖維化的形成。這從微觀病理學角度說明柿葉乙酸乙酯部位能促進腫瘤細胞的死亡，抑制S180荷瘤小鼠腫瘤細胞的生長。柿葉乙酸乙酯部位是否確實能誘導腫瘤細胞早期凋亡，需對瘤組織進行超微結構的觀察。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）06-1339-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.041

2014-03-12

廣西醫(yī)學科學實驗中心開放基金專項項目 （KFJJ2011-17）

陳 麗（1977—），女，碩士，副教授，研究方向為生化藥理學及中藥新劑型。E-mail：chenlilzyz@163.com。

*通信作者：陳 君，女，碩士，副教授，研究方向為中藥、民族藥有效成分與質量標準。