基于自由基學說研究決明子水煎液對小鼠靜止代謝率和抗氧化活性的影響

吳宿慧， 劉亞敏， 李寒冰， 李根林

（河南中醫學院，河南鄭州450046）

基于自由基學說研究決明子水煎液對小鼠靜止代謝率和抗氧化活性的影響

吳宿慧， 劉亞敏， 李寒冰， 李根林*

（河南中醫學院，河南鄭州450046）

目的在自由基學說的指導下，研究決明子水煎液對小鼠靜止代謝率和抗氧化活性的影響，為決明子輕身延年的作用機制提供理論和實驗依據。方法制備決明子水煎液質量濃度為1 g（生藥質量）/mL，50只SPF級ICR小鼠隨機分為5組，即空白對照組，決明子高 （20 mg/kg）、中 （10 mg/kg）、低 （5 mg/kg）劑量組，維生素E（VE）組（陽性對照，5 mg/kg），每組10只，自由飲水和取食。每天上午9點測體質量、灌胃給藥，連續給藥28 d，每天1次，給藥體積為20mL/kg。實驗結束前一天測定動物靜止代謝率 （RMR），當晚20點禁食，第2天早上處死動物，取血清，ELISA方法測定SOD、GSH-Px和MDA及胰脂肪酶、脂聯素等指標。結果與空白對照組相比，隨著決明子劑量增大，小鼠體質量、胃腸濕重和胃腸指數與靜止代謝率等整體指標均有顯著性降低，并與劑量呈現明顯量效關系，不同給藥組的GSH-Px濃度、SOD酶活力均無顯著變化，P＞0.05，而MDA在決明子高劑量組和中劑量組有顯著降低，P＜0.05。決明子高劑量組和中劑量組的胰脂肪酶活力有顯著降低，P＜0.05。各給藥組脂聯素水平無顯著性差異。相關分析結果表明：血清中GSH-Px水平與靜止代謝率 （RMR）之間無顯著性相關關系 （R=-0.217，P＞0.05）；SOD活力與RMR之間有極顯著的負相關關系（R=-0.580，P＜0.001）；MDA濃度與RMR之間有極顯著的正相關關系 （R=0.421，P＜0.05）。結論該結果符合預測，支持假說，也表明了自由基學說在小鼠靜止代謝率和衰老研究中的橋梁作用。該實驗為探究決明子抗衰老的藥理作用機制提供了理論和實驗依據，亦為指導其臨床合理應用提供了強有力的證據。

決明子；小鼠；抗衰老；靜止代謝率；抗氧化作用

衰老是多因素導致的身體機能的下降，同時伴隨著生化和生理功能的減弱，因此對外界環境、壓力、挑戰等反應會有所降低，更易患上年齡相關的疾病而死亡［1］。在對衰老現象的探索中，衰老形成的原因與能量支出之間聯系已經有近2個世紀的研究歷史了［2］，若個體能量支出增加，則可能導致壽命減少。Pearl把這種現象成為“rate-of-living”，認為生物體的壽命是固定的，如果動物浪費過多精力，壽命則減少；如果節約降低生活成本，則壽命延長［3］。自由基學說把衰老研究和代謝聯系起來，并認為呼吸代謝氧化磷酸化過程中產生過多的自由基對生物體大分子物質的氧化損傷會加速衰老的進程［4］。在對體內自由基的清除作用進行研究時，超氧化物歧化酶 （SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）及丙二醛（MDA）是一貫的焦點。且在衰老過程中，如何降低高血脂，預防肥胖、糖尿病等疾病的發生也受到了廣泛的關注。

決明子Cassiae Semen為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明Cassia tora L.的干燥成熟種子，是國家衛生部公布的69種藥食同源品種之一，性味甘、苦、咸、微寒。歸肝、大腸經。本草記載具有 “輕身”作用，現代藥理研究具有清熱明目，潤腸通便之功效，常作各種保健用途［5］。古人有詩云：愚翁八十目不膜，日書蠅頭夜點星，并非生得好眼力，只緣常年服決明。中醫養生理論認為可以從食補、藥補以及采取自我調攝等為主的綜合措施以達到延緩衰老、延年益壽的目的。課題組在前期研究中，基于自由基學說，通過直接觀察決明子水煎液對家蠶壽命的影響及機制探討發現：決明子水煎液能延長家蠶壽命，降低氧耗，并且體內SOD等抗氧化物質活性有所增強，同時發現決明子潤腸通便之功效影響到機體對能量的攝取與支出，這可能是決明子發揮作用的主要途徑之一。為了進一步研究決明子抗衰老作用及其機制，課題組又開展了一系列以小鼠為研究對象的實驗，測定了以靜止代謝率 （RMR）為代表的能量支出，以SOD、GSH-Px和MDA為代表的抗氧化指標，及以胰脂肪酶和脂聯素為代表的調血脂指標，以期為決明子新的藥用開發提供參考和依據?？梢灶A測：若決明子抗衰老作用符合自由基學說，那么與之相聯系的抗氧化指標如SOD、GSH-Px及MDA則會有不同程度的活性變化，能量支出降低。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗藥物 決明子購自鄭州市本草國藥館，經河南中醫學院中藥資源鑒定教研室陳隨清教授鑒定為豆科植物決明Cassia obtusifolia L.的干燥成熟種子，為《中國藥典》2010年版收載的正品；維生素E由青島雙鯨藥業有限公司生產 （國藥準字H20043134，批號001008）。

1.2 實驗動物 ICR小鼠，SPF級，體質量18～22 g之間，由河南省實驗動物中心提供，其許可證號SCXK（豫）2010-0002，動物合格證號：0008433。動物飼養室環境溫度控制在 （25±2）℃，光周期為12L∶12D，整個實驗過程中，動物自由飲水和取食。

1.3 試劑與儀器 超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒（批號20121105）、丙二醛 （MDA）ELISA試劑盒 （批號20121108）、谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px）ELISA試劑盒 （批號20121101）、胰脂肪酶 ELISA試劑盒 （批號20121112）、脂聯素ELISA試劑盒 （批號20121115），以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

BIORAD-680酶標儀（Bio-Rad Laboratories）；DZKW-4電子水浴鍋 （上海東星建材試驗設備有限公司；BS-210S電子分析天平 （北京賽多利斯天平有限公司）；SZ-093雙重蒸餾器（上海市亞榮生化儀器廠）；TDL-40B型低速臺式離心機 （上海安亭科學儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 決明子水煎液的配置 稱取決明子100.0 g，常溫下加10倍量雙蒸水煎煮1 h，過濾，藥渣加800mL水再次煎煮1 h，合并兩次濾液，濃縮至100 mL。每1 mL含生藥質量1 g，放置冰箱中 （0～4℃）保存備用。用時稀釋成相應濃度。

2.2 實驗分組 50只ICR小鼠隨機分為5組，雌雄各半，分開飼養。分別為空白對照組，決明子水煎液高、中、低劑量組，陽藥對照組。每天上午9點灌胃給藥，連續給藥28 d，每天1次，給藥體積為20 mL/kg。高劑量組給藥劑量為20 mg/kg；中劑量組給藥劑量為10 mg/kg；低劑量組給藥劑量為5 mg/kg；陽性對照藥維生素E組給藥劑量為5 mg/kg；空白組給相同體積的蒸餾水。每天稱取動物體質量，按照體質量給藥。

2.3 呼吸代謝測定 實驗結束前一天給藥后，用CYES-H型O2、CO2氣體測定儀 （上海精勝科學儀器有限公司）測定動物RMR，測定前，將儀器放在新鮮空氣環境中 （室溫20～25℃，濕度70%），在進氣口接一根長約20 cm的硅膠管，另一端和被測氣體相連。以空氣中氧濃度21.0%定標，待讀數穩定后，再定CO2濃度。之后，把小鼠放入一個容積為2 L的密閉容器里，用KOH和干燥硅膠吸收呼吸室內的CO2和水分，放置在30℃ （小鼠的熱中性區溫度）恒溫箱內1 h，待動物穩定后，開始記錄耗氧量，每隔5 min記錄1次，連續測定1 h。選取2個連續穩定的最低值來計算RMR。代謝率 （耗氧量）值均校對為標準狀態 （0℃，1個大氣壓）下。每次完成讀數后，用新鮮空氣清洗氣路，重新定標調零。重復3次。以耗氧量 （mL·g-1·h-1）表示其代謝速率。

2.4 血清中各指標測定 末次給藥后1 h，摘眼球取血，為了減少食物對各指標的影響，處死前一天晚上20點開始禁食12 h。血液4 000 r/min離心，取血清，血清中超氧化物歧化酶 （SOD）活力、丙二醛 （MDA）水平、谷胱甘肽過氧化物酶 （GSH-Px）活力及胰脂肪酶與脂聯素水平均根據ELISA試劑盒所附方法及步驟進行測定。

2.5 數據處理 所得數據運用獨立樣本T檢驗性別差異，各組均P＞0.05，故做為整體一起統計。

結果用x±s表示。數據分析用SPSS 17.0統計軟件，組間比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），多重比較采用Turkey HSD方法進行分析。

3 實驗結果

3.1 體質量、胃腸濕質量和胃腸指數 單因素方差分析結果表明：體質量在不同處理組間雖然有下降的趨勢，但統計上無顯著性差異 （F4，36=0.634，P＞0.05，one-way ANOVA）。胃腸濕質量在各處理組間有顯著性差異（F4，36=5.795，P＜0.01，one-way ANOVA）。胃腸指數在各處理組間亦有顯著性差異 （F4，36=14.480，P＜0.001，one-way ANOVA）。

多重比較（Turkey HSD）結果表明：體質量無論與空白組比較，還是與陽性對照藥 （VE）組比較，各組間均無顯著性差異。胃腸濕質量與空白對照組相比時，決明子水煎液高劑量組和中劑量組均有顯著性差異，顯著性水平均為P＜0.01，決明子水煎液低劑量組未見顯著性差異；與陽性藥組比較時均無顯著性差異。胃腸指數與空白對照組比較時，決明子水煎液高劑量組和中劑量組均有顯著性差異，顯著性水平均為P＜0.001，決明子水煎液低劑量組未見顯著性差異；與陽性藥組比較時僅決明子水煎液高劑量組有顯著性差異，P＜0.05。見表1。

3.2 靜止代謝率 （RMR） 單因素方差分析結果表明：不同組間的靜止代謝率有顯著性差異 （F4，36=3.783，P＜0.05，one-way ANOVA）。多重比較（Turkey HSD）結果表明：若與空白對照組相比，決明子高劑量組與中劑量組靜止代謝率有顯著降低，顯著性水平均為P＜0.05，決明子低劑量組無顯著差異。若與陽性對照藥相比，3個給藥組則均無顯著性差異，P＞0.05。見表2。

表1 不同劑量決明子水煎液對小鼠體質量、胃腸濕質量、胃腸指數的影響 （x±s，n=10）

表2 不同劑量決明子水煎液對小鼠靜止代謝率 （RM R）的影響（x±s，n=10）

3.3 對血清中GSH-Px、SOD、MDA的影響 單因素方差分析結果表明：不同組間的GSH-Px質量濃度無顯著性差異（F4，35=0.693，P＞0.05，one-way ANOVA）。不同組間的SOD酶活力有顯著性差異 （F4，36=2.801，P＜0.05，one-way ANOVA）。不同組間的MDA濃度有極顯著性差異（F4，36=4.098，P＜0.01，one-way ANOVA）。

多重比較（Turkey HSD）結果表明：若與空白對照組相比，不同給藥組的GSH-Px質量濃度、SOD酶，活力均無顯著變化，P＞0.05，而MDA在決明子高劑量組和中劑量組有顯著降低，P＜0.05，P＜0.05。與陽性對照藥組相比，不同給藥組的GSH-Px水平、SOD酶活、MDA水平均無顯著變化，P＞0.05。見表3。

表3 不同劑量決明子水煎液對小鼠血清中GSH-Px、SOD、MDA的影響（x±s，n=10）

3.4 對血清中胰脂肪酶、脂聯素的影響 單因素方差分析結果表明：各組間的胰脂肪酶活力有顯著性差異 （F4，36= 3.329，P＜0.05，one-way ANOVA）。不同組間的脂聯素水平無顯著差異（F4，36=0.767，P＞0.05，one-way ANOVA）。

多重比較（Turkey HSD）結果表明：若與空白對照組相比，決明子高劑量組和中劑量組的胰脂肪酶活力有顯著降低，P＜0.05。各給藥組脂聯素水平無顯著性差異。與陽性對照藥組相比，不同給藥組的胰脂肪酶活力、脂聯素水平均無顯著變化，P＞0.05。見表4。

表4 不同劑量決明子水煎液對小鼠血清中胰脂肪酶、脂聯素的影響 （x±s，n=10）

3.5 RMR與血清中GSH-Px、SOD、MDA的相關分析 皮爾遜相關（Pearson correlation）分析結果表明：血清中GSH-Px質量濃度與靜止代謝率（RMR）之間無顯著性相關關系（R=-0.217，P＞0.05），見圖1；血清中SOD活力與靜止代謝率 （RMR）之間有極顯著的負相關關系（R=-0.580，P＜0.001），見圖2；血清中MDA濃度與靜止代謝率 （RMR）之間有顯著的正相關關系（R=0.421，P＜0.05），見圖3。

圖1 血清中GSH-px濃度與靜止代謝率（RM R）之間的相關關系

圖2 血清中SOD酶活力與靜止代謝率（RMR）之間的相關關系

4 討論

圖3 血清中M DA濃度與靜止代謝率（RMR）之間的相關關系

實驗中能量支出與壽命的關系比較復雜。很多物種中，靜止代謝率（RMR）和基礎代謝率 （BMR）可能與壽命有關系［6-7］。 文獻報道實驗手段增加小鼠［8］及大鼠［9］、 田鼠［10］的能量支出，RMR增加，卻沒有增加其壽命。也有報道：適當運動致能量支出增加，小鼠壽命則有延長［11］。無脊椎動物實驗結果則更多傾向于：能量支出減少，壽命延長。例如：低溫或巢穴減小造成的家蠅（Musca domestica）和果蠅 （Drosophila.）活動減少能增加壽命［12-13］。烏龜亦是如此。目前，后者公認度更為廣泛。研究證實，限制熱量攝入，代謝率降低，是廣泛適用于各類動物種屬的抗衰老方法。

本實驗中，隨著決明子劑量增大，小鼠體質量、胃腸濕質量和胃腸指數與靜止代謝率等整體指標均有顯著性降低，并與劑量呈現明顯量效關系，這與決明子的潤腸通便之功效相符，表明機體可能通過胃腸內容物減少，體質量降低。根據能量平衡原理，攝入的能量若有減少，則供機體支出的能量也會減少，故靜止代謝率會降低。

自由基學說相聯系的指標，MDA是膜脂過氧化終產物，衰老時，活性氧積累誘發膜脂過氧化加快，MDA增多。SOD作為生物體內的 “垃圾清道夫”，可清除機體內的超氧陰離子自由基。GSH-Px作為機體中重要的過氧化物分解酶，對保護細胞膜的結構和功能不受過氧化物的干擾和損害。在決明子水煎液的作用下，若與空白對照組相比，血清中MDA在高劑量組和中劑量組有極顯著地降低，SOD和GSH-Px則略有升高，但無顯著統計學意義；與維生素E組相比，均無顯著差異。符合預測，支持假說。

自由基學說把衰老研究與能量代謝聯系起來，本實驗對抗氧化指標和靜止代謝率進行相關分析，結果表明：血清中GSH-Px水平與靜止代謝率（RMR）之間無顯著性相關關系（R=-0.217，P＞0.05）：SOD活力與靜止代謝率（RMR）之間有極顯著的負相關關系（R=-0.580，P＜0.001）；MDA濃度與靜止代謝率 （RMR）之間有極顯著的正相關關系 （R=0.421，P＜0.05），可推測：SOD增多，MDA減少，則RMR降低，壽命得到延長。由此可知，自由基學說在小鼠靜止代謝率和衰老研究中起到了紐帶作用。

在體內，脂肪酸的氧化過程有大量氧化中間產物生成，且過多的脂肪會引起肥胖、糖尿病等一系列代謝綜合征，加速衰老進程。在對代謝綜合征的研究中發現，人體對食物脂肪的攝入是直接或間接的誘因，控制食物脂肪的攝入，可有效地控制高脂血癥的出現，并可預防肥胖、糖尿病等疾病的發生。胰脂肪酶水解膳食脂肪，可調節機體的血脂水平。脂聯素是脂肪細胞分泌的一種胰島素增敏激素，可調節機內的血糖水平。在決明子水煎液的作用下，與空白對照組相比，高劑量組和中劑量組血清中胰脂肪酶水平有顯著降低，脂聯素水平略有升高，但無顯著差異。該結果表明決明子降脂作用與胰脂肪酶活性抑制有關，與研究組前期體外結果一致［14］，可能是決明子作為傳統 “輕身”藥、現代減肥藥的基礎［15］。

《神農本草經》將決明子列為上品，謂其"主青盲、目淫、膚赤、白膜、眼赤通、淚。服益精光，輕身"。而中醫中的輕身是指機體處于健康狀態，如 “輕身延年”［15-16］?，F代藥理學研究表明中藥有效成分可與體內自由基結合，抑制過氧化反應，降低脂褐素和增齡色素的沉積，延緩衰老［15］。本實驗中，不同劑量的決明子水煎液使小鼠體內的抗氧化指標SOD、GSH-Px活力有一定升高、MDA濃度有顯著降低，我們推測，這一結果與決明子的功效息息相關：其具有的潤腸通便之功效可以排出隨年齡增長而在體內積累的毒素，另外決明子的抗氧化作用可清除糖、脂肪、蛋白質代謝過程中產生的自由基，避免大分子物質交聯，使機體氧化應激能力增強，改善衰老狀態。符合預測，支持了自由基學說。該研究結果對于探究決明子的藥理作用機制提供了理論和實驗依據，也為指導其臨床合理應用提供了強有力的證據。

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2014-02-28

河南中醫學院博士科研基金 （BSJJ2009-37）；金水區技術研究與開發經費支持項目 （金科 ［2011］31號項目序號：45）；河南省教育廳科學技術重點資助項目 （14A310023）

吳宿慧，博士，講師，主要從事藥理學和中藥藥理學研究。E-mail：iwusuhui@163.com

*通信作者：李根林，教授，主要從事中藥抗衰老作用研究。E-mail：lhb8899@163.com

日期：2014-12-16

網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20141216.1005.001.html