正交試驗優選易寧更年顆粒水提工藝及藥效學對比

彭 靜， 陳志良*， 梁 磊， 鄧虹珠， 易延逵

（1.南方醫科大學南方醫院藥學部，廣東 廣州 510515；2.廣州軍區廣州總醫院，廣東 廣州 510010；3.南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州510515）

正交試驗優選易寧更年顆粒水提工藝及藥效學對比

彭 靜1， 陳志良1*， 梁 磊2*， 鄧虹珠3， 易延逵3

（1.南方醫科大學南方醫院藥學部，廣東 廣州 510515；2.廣州軍區廣州總醫院，廣東 廣州 510010；3.南方醫科大學中醫藥學院，廣東廣州510515）

目的優選易寧更年顆粒水提取工藝。方法HPLC法測定特女貞苷，以特女貞苷量和浸膏得率為綜合評價指標，通過正交試驗優選藥材浸泡時間、加水量與提取時間；采用免疫低下小鼠碳粒廓清功能作為工藝改變的藥效評價指標，將優選工藝與原工藝進行比較。結果正交設計水提取優化結果為浸泡0.5 h，第1次加水量為10倍量，提取2 h，第2次加水為8倍量，提取1 h。原工藝與現工藝對免疫低下小鼠碳粒吞噬指數K和校正吞噬指數a均有提高，且優選工藝對碳粒廓清功能增強更顯著 （P＜0.05）。結論該工藝簡單、易行，能夠有效地提取女貞子中的特女貞苷，較原工藝能夠更加有效地提高免疫低下小鼠碳粒廓清功能。

女貞子；特女貞苷；易寧更年顆粒；正交試驗；高效液相色譜法；碳粒廓清

易寧更年顆粒由女貞子、墨旱蓮、當歸等多味藥材組成的中藥復方制劑，突出顯示滋陰補腎、行氣開郁等功效，能有效地調節女性圍絕經期的諸多癥狀。作為醫院制劑長期用于女性更年期癥狀，尤其在增強免疫功能相關癥狀時療效顯著。女貞子作為該方中君藥，具有調節免疫力、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、降血脂等廣泛的藥理作用［1-3］。已有化學研究表明，女貞子主要含有三萜類的脂溶性成分，對羥基苯乙醇苷類和裂環環烯醚萜苷類等水溶性成分［4］，以及多糖、揮發油、微量元素等多種化學成分。其中水溶性成分特女貞苷是女貞子的主要有效成分之一［5］。根據現行的 《中國藥典》2010年版，以特女貞苷作為女貞子藥材的質量控制方法。本實驗采用正交優化設計，以藥材浸膏得率以及特女貞苷的量為考察指標，篩選最優工藝；并結合對免疫低下小鼠碳粒廓清功能的影響作為工藝改進藥效評價指標進行綜合評估，為本制劑的提取工藝提供一個科學的試驗依據。

1 材料

1.1 儀器 Aglient1100高效液相色譜儀；電子天平（德國sartrius BP110S）；超聲清洗儀（昆山禾創超聲儀器有限公司）；十萬分之一天平 （Sartorius）；微量進樣器 （Eppendorf公司）；多功能酶標儀M5（美國MDS公司）。

1.2 試藥 易寧更年顆粒 （自制），貞芪扶正顆粒 （上海靜安制藥有限公司，批號140208-2），特女貞苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111926-201203），女貞子和墨旱蓮藥材 （廣州康圣藥業有限公司），無水Na2CO3（廣東光華化學有限公司），印度墨汁和環磷酰胺 （廣州市齊云生物技術有限公司），甲醇為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 昆明 （KM）小鼠60只，雌性，體質量18～22 g，由南方醫科大學實驗動物中心提供 （合格證號：SCXK［粵］2011-0015），實驗前動物先適應性喂養3 d。

2 方法與結果

2.1 特女貞苷測定

2.1.1 色譜條件 Thermo scientific色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm），以甲醇-水 （35∶65）為流動相，檢測波長為224 nm，體積流量為1 mL/min，柱溫為30℃。對照品進樣量為5μL，供試品為10μL。標準曲線為Y=175.1X+ 26.29（r=0.999 5），表明特女貞苷在0.202 3～3.034 5μg具有良好的線性關系。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷干燥器中減壓干燥24 h的特女貞苷對照品適量，加甲醇溶解制成每1 m L含0.203 2 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取女貞子和墨旱蓮適量，按照提取次數試驗和正交設計試驗提取，將提取液濃縮至一定體積后，按照提取次數試驗進行的濃縮液5 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容；而正交試驗的濃縮液取1 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液得到供試品溶液。

2.1.4 樣品測定 精密吸取供試品濃縮液適量注入高效液相色譜儀，按照文獻［6］測定，計算各樣品中特女貞苷的量。

2.1.5 浸膏得率測定 根據試驗設計方案，精密吸取已定容的各供試品濃縮液過濾后取25mL，水浴蒸干，105℃干燥3 h，放冷至室溫稱定質量，計算浸膏得率。

2.2 女貞子水提工藝考察

2.2.1 將女貞子打碎的粗粉與未打碎的果實分別與墨旱蓮適量進行水提，對女貞子是否打碎進行考察，試驗過程加10倍量水，提取4 h，進行3次平行試驗，按照 “2.1.3”項下提取次數的制備方法制備供試品溶液，用于特女貞苷提取率測定，根據 “2.1.5”項下方法處理得到浸膏得率，試驗安排和結果見表1。

從表1結果得出，打碎的女貞子浸膏得率和特女貞苷含有量均比未打碎的高，且打碎后的女貞子特女貞苷含有量明顯提高，因此在后續的試驗中考慮將女貞子打碎后進行提取。

2.2.2 提取次數考察 稱取女貞子和墨旱蓮適量，將女貞子打碎，加10倍量水提取3次，每次1.5 h，進行3次平行試驗，按照 “2.1.3”項下方法制備供試品溶液，用于測定浸膏得率、特女貞苷提取率，結果見表2。

表1 打碎和未打碎女貞子對易寧更年顆粒提取工藝的影響

表2 提取次數選擇試驗結果

根據表2結果分析得出：第2、3次浸膏得率和特女貞苷含有量與第1次差異明顯，第3次提取浸膏得率占總浸膏得率的比例較小，特女貞苷提取量占特女貞苷提取總量的比例小于10.0%，說明提取2次已基本提取完全，故提取次數定為2次。

2.2.3 水提條件優選 以浸膏得率、特女貞苷提取量為考查指標，采用正交試驗對水提條件進行優選，根據特女貞苷的理化性質，設計因素水平表，見表3。

表3 正交設計因素水平

依表，用L9（34）正交表安排試驗，按處方稱取女貞子和旱蓮草各50 g平行9份，女貞子打碎，加水提取，過濾，合并濾液，定容至一定體積。分別測定浸膏得率、特女貞苷含有量，并進行多指標綜合評分。評分時以各指標的最大值為參照將數據進行歸一化處理，再根據各指標成分在工藝選擇中的主次地位，給以不同的加權系數。有效成分特女貞苷含有量為主要評價指標，設權重為0.7，浸膏得率為次要評價指標，設權重為0.3。即綜合評分：100%。結果見表4和5，數據按照文獻［8］用SPSS13.0處理得到。

以特女貞苷含有量和浸膏得率為綜合評價指標進行考察，從以上表格直觀分析得出，影響特女貞苷水提取效果的因素主次順序為：C＞B＞A，最佳提取工藝為A2B2C2。方差分析結果顯示A，B，C三個因素中均具有統計學意義，因此，得到最佳提取工藝為藥材加水浸泡0.5 h，第1次加水10倍量提取2 h，第2次加水8倍量提取1 h。

表4 正交試驗及結果

表5 綜合評分方差分析結果

2.3 驗證試驗 因本實驗優選的工藝并未包括在9次正交設計試驗中，故進行驗證試驗。稱取女貞子和墨旱蓮各50 g，共3份，按照優選工藝A2B2C2進行提取，按照“2.1.3”項正交試驗制備方法制備供試品溶液，結果3次提取工藝的浸膏得率分別為25.17%、25.60%、25.46%，RSD為1.0%，特女貞苷提取量為24.12、24.89、24.59 mg/g藥材，RSD為1.6%，說明工藝基本可行。

2.4 藥效學試驗

2.4.1 實驗動物造模和分組 環磷酰胺模型組第1、2、3天皮下注射環磷酰胺80 mg/kg，隔1周后強化注射1次進行造模。將60只小鼠隨機分為5組，每組12只。空白對照組 （生理鹽水）、環磷酰胺模型組 （生理鹽水）、易寧更年顆粒組 （3.3 g/kg，相當于臨床用量20倍）、原工藝組（含生藥材6.4 g/kg，相當于臨床用量20倍）、貞芪扶正顆粒組 （3.3 g/kg，相當于臨床用量20倍）。各組按照20 mL/kg體質量灌胃給藥，每日1次，連續15 d。

2.4.2 碳粒廓清功能實驗［9］于末次給藥1 h后，將稀釋3.5倍的印度墨汁按10 mL/kg劑量給予小鼠尾靜脈注射后，分別于2 m in、10 min內眥采血，取20μL血液立即加入含有0.1%Na2CO32m L的EP管中，搖勻，于600 nm處測定吸光度 （OD）值。取血后小鼠采用頸椎脫臼法處死，取肝臟、脾臟稱定質量。計算各組小鼠一定時間內血液中碳粒吞噬指數K及校正吞噬指數α，采用SPSS 13.0軟件進行統計處理，完全隨機設計資料的多個樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，方差齊，采用LSD法，P＜0.05具有統計學意義，結果見表6。

表6 兩種不同工藝對免疫低下小鼠碳粒廓清功能的影響

結果表明優選的易寧更年顆粒較原工藝比較具有顯著性差異和統計學意義。

3 討論

目前，關于女貞子低極性的有效成分齊墩果酸的提取工藝和藥理作用研究較多［10-11］，并在2010年版 《中國藥典》以特女貞苷為標準前，是以齊墩果酸量為控制指標。近幾年隨著女貞子化學成分的深入研究，關于其水溶性成分作為藥效成分研究越來越多［12-14］。由于中藥復方大部分是以水煎液為主，本研究采用操作簡單、成本較低的水提取方法。本實驗根據文獻［15］以及現行的 《中國藥典》2010年版，以女貞子藥材中水溶性成分特女貞苷含有量為主要評價指標，結合藥材浸膏得率綜合考察、設計本實驗的提取工藝。以制劑中特女貞苷的含有量和浸膏得率優選工藝，得到優選工藝的特女貞苷含有量和浸膏得率較原工藝均有所提高 （P＜0.05）。

藥效試驗碳粒廓清功能屬于非特異性免疫，是免疫應答的一個重要方面。碳粒廓清指數K的大小反映注入血液中惰性碳粒的吞噬廓清能力和速度，而吞噬指數α則是排除體質量、肝臟和脾臟的影響校正后的評價指標，更加科學、準確。中藥復方是一個多靶點、多效應、發揮綜合作用的制劑，而本研究基于該制劑臨床作用在免疫方面療效顯著的特點以及各藥材的藥理作用，甄選碳粒廓清功能藥效學指標進行前后工藝的比較與驗證，結果得出：優選工藝比原工藝的碳粒廓清功能有所提高，并具有統計學差異。根據前后工藝的質量控制和藥效試驗二者作為綜合評價指標，不僅保證了有效成分的提取率，又對中藥復方的綜合藥效提供了科學的根據。

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R284.1

：B

：1001-1528（2015）06-1350-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.044

2014-08-18

國家自然科學基金青年基金 （81001701）；廣州市科技計劃項目珠江科技新星專項 （2013J2200030）

彭 靜（1988—），女（土家族），碩士，從事藥劑學研究。Tel：15625063751，E-mail：pengjinghj@126.com

*通信作者：陳志良 （1950—），男，博士生導師，教授，從事新藥設計與評價。Tel：（020）61648263梁 磊 （1978—），女，博士，主管藥師，從事中藥藥理研究。Tel：（020）36652218