玄參中環烯醚萜類物質的分離純化工藝

李祚丹， 季金茍， 楚莎莎， 何 慧， 穆小靜， 徐 溢

（重慶大學化學化工學院藥學系，重慶400044）

玄參中環烯醚萜類物質的分離純化工藝

李祚丹， 季金茍*， 楚莎莎， 何 慧， 穆小靜， 徐 溢

（重慶大學化學化工學院藥學系，重慶400044）

目的提高玄參中環烯醚萜類物質的分離純化效果。方法以哈巴俄苷的吸附率和解吸率為評價指標，篩選樹脂，優化吸附和解吸條件，并重點考察了pH對其的影響。結果HPD100型大孔吸附樹脂能較好地分離純化玄參中環烯醚萜類物質。在樣品溶液pH 4，吸附時間48 h條件下，對哈巴俄苷吸附率可達95.58%；在洗脫劑為80%乙醇，pH 8，6 BV條件下，對其解吸率可達95.35%。結論HPD100型大孔吸附樹脂對玄參中環烯醚萜類物質有較好的分離純化作用，并且適當調節樣品和洗脫液的pH可進一步提高其效果。

玄參；環烯醚萜；哈巴俄苷；大孔吸附樹脂；分離純化

環烯醚萜是我國傳統中藥玄參中的一類化學物質［1-2］，具有多種藥理活性，如抗病毒、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗細胞染色體誘變、促進胰腺分泌、增強免疫作用，并且還對心血管系統、神經系統、消化系統有影響［3-4］。按結構分類，玄參中的環烯醚萜可分為取代環戊烷環烯醚萜苷和環戊烷開裂的裂環式環烯醚萜苷，代表性物質為哈巴苷、哈巴俄苷［1，5］。目前，常用硅膠柱層析法分離純化該類成分時存在成本高、再生處理不方便等缺點，而大孔吸附樹脂具有比表面積大、吸附容量高、選擇性好、吸附速度快、再生處理方便、使用周期長等諸多優點，因而是目前的研究熱點［6-7］。本實驗用大孔吸附樹脂對玄參中環烯醚萜類物質的分離純化進行了研究，除了考察常規的吸附時間、洗脫劑濃度等因素對吸附率和解吸率的影響［8-10］外，還重點關注了pH對其的影響，以期得出更好的分離純化工藝。

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器設備 T6新世紀紫外可見分光光度計 （北京普析通用儀器有限責任公司）；THZ-C恒溫震蕩箱 （江蘇太倉市實驗設備廠）；KQ-2200B超聲波清洗器 （鞏義市予華儀器有限責任公司）；RE-2000A旋轉蒸發儀 （上海嘉鵬科技有限公司）；Phs-3C型精密pH計 （上海雷磁儀器廠）。

1.2 材料與試劑 哈巴俄苷對照品 （純度＞98%，西安朗鴻生物科技有限公司）；玄參 （重慶中藥材公司）；NKAII、AB-8、D101大孔吸附樹脂 （南開大學化工廠）；HPD100、HPD450大孔吸附樹脂 （滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、鹽酸（分析純，重慶川東化工集團有限公司）；氫氧化鈉 （分析純，成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法

2.1 樣品溶液制備 稱取玄參干燥根部50 g，切塊，5倍量水浸泡24 h，70℃下加熱回流3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏，加適量水溶解，依次用乙酸乙酯、正丁醇分別萃取3次［2］。之后將正丁醇部分減壓濃縮，再加水溶解，定容至1 000mL，備用。

2.2 標準曲線的建立 鑒于哈巴俄苷為玄參中環烯醚萜類成分的代表性物質［5］，且 《中國藥典》在鑒別玄參藥材時也以其為參考標準［11］，故本實驗以哈巴俄苷為玄參中環烯醚萜類物質的指標。

精密稱取哈巴俄苷對照品0.027 2 g，30%甲醇溶解，定容至50 mL，精密吸取其中2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 m L，分別置于1～5號10 mL量瓶中，30%甲醇定容。以30%甲醇溶液為參比，在190～600 nm范圍內光譜掃描，在最大吸收波長處以質量濃度X（mg/mL）為橫坐標，吸光度 （Y）為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，得到回歸方程。

2.3 大孔吸附樹脂的預處理 在樹脂柱內加入高于樹脂層10 cm的乙醇，浸泡24 h后放出浸液，蒸餾水反復洗滌至洗滌液加水稀釋不渾濁，并且紫外光譜掃描時無吸收峰出現為止。

2.4 大孔吸附樹脂的選擇 精密稱取AB-8、D101、HPD100、HPD450、NKA-II5種樹脂各5.00 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入樣品溶液50.00 mL，30℃下振搖吸附48 h，測定溶液中哈巴俄苷的質量濃度，計算吸附率。再將吸附后的樹脂過濾，60%乙醇50.00 mL振蕩解吸24 h，測定解吸液中哈巴俄苷的質量濃度，計算解吸率，以篩選出最適宜分離純化玄參中環烯醚萜類物質的樹脂。吸附率和解吸率按公式 （1）和 （2）計算。

注：ρ0為吸附前溶液質量濃度 （mg/m L）；ρ1為吸附后溶液質量濃度（mg/mL）；ρ2為解吸液質量濃度（mg/m L）；V1為樣品溶液體積 （mL）；V2為解吸液體積 （mL）。

2.5 分離純化條件的研究

2.5.1 樣品溶液pH對吸附率的影響 取8份樣品溶液各50 mL，以0.01 mol/L HCl和0.01 mol/L NaOH將其pH分別調為3、4、5、6、7、8、9、10，置于8個裝有5.00 g經預處理的樹脂的錐形瓶中，30℃下振蕩吸附48 h，測定溶液中哈巴俄苷的質量濃度，計算吸附率。

2.5.2 靜態吸附時間對吸附率的影響 取經預處理的樹脂5.00 g，置于錐形瓶中，精密加入200.00 mL“2.5.1”項的樣品溶液，30℃下每隔4 h取樣一次，測定溶液中哈巴俄苷的質量濃度，計算吸附率。之后將吸附飽和的大孔樹脂懸浮液離心，除去殘液及樹脂表面水分，留待備用。

2.5.3 乙醇體積分數對解吸率的影響 向錐形瓶中加入已達到吸附平衡的樹脂5.00 g，再分別加入50.00 mL不同體積分數的乙醇溶液進行洗脫，30℃下振蕩解吸24 h，收集各乙醇體積分數下的洗脫液，分別測定各洗脫液中哈巴俄苷的質量濃度，計算解吸率。

2.5.4 洗脫劑pH對解吸率的影響 向錐形瓶中加入已達到吸附平衡樹脂的5.00 g，再分別加入pH分別為5、6、7、8、9、10的洗脫劑50.00 mL，30℃下振蕩解吸24 h，收集各pH下的洗脫液，分別測定各洗脫液中哈巴俄苷的質量濃度，計算解吸率。

2.5.5 洗脫劑用量對解吸率的影響 取已達到吸附平衡的樹脂5.00 g裝柱，2.0 mL/min體積流量下用“2.5.4”項的洗脫劑洗脫，每10.00 mL為1份收集，分別測定每份洗脫液中哈巴俄苷的質量濃度，計算解吸率。

3 結果

3.1 標準曲線的建立 通過光譜掃描，確定哈巴俄苷的檢測波長為283 nm，以對照品質量濃度X（mg/mL）為橫坐標，吸光度 （Y）為縱坐標，繪制標準曲線，并進行線性回歸，得回歸方程Y=1.455 9X+0.060 8，r2=0.999 3，表明哈巴俄苷在0.108 8～0.544 mg/mL范圍內線性關系良好。

3.2 不同型號大孔吸附樹脂對玄參中環烯醚萜分離效果的影響 表1為不同型號大孔吸附樹脂對哈巴俄苷分離效果的影響。表1所示，5種樹脂的吸附和解吸性能有所差異，其中HPD100型大孔吸附樹脂對哈巴俄苷吸附和解吸效果最好，吸附率能達到95.56%，而解吸率能達到86.21%。綜合考慮，本實驗選擇HPD100型大孔吸附樹脂用于分離純化玄參中的環烯醚萜類物質。

表1 大孔吸附樹脂的篩選（n=3）

3.3 樣品溶液pH對吸附率的影響 圖1為樣品溶液pH對吸附率的影響，由圖可見，該影響較大。pH＜4時，樹脂對哈巴俄苷的吸附率隨pH的增加而上升；pH4時，吸附率達到最大；pH＞4時，吸附率會顯著下降。推測可能是由于HPD-100大孔吸附樹脂是苯乙烯型非極性共聚體，因而對非極性物質作用力較強的緣故。哈巴俄苷等環烯醚萜類化合物是一類含有較多羥基的弱酸性物質，在pH4時，以分子狀態存在居多，故與HPD-100大孔吸附樹脂作用力較強；酸性增強時，可能會產生較多的羥基質子化物質，因而與該型號樹脂作用力減弱；堿性增加時，以共軛堿負離子形式存在，因而與該型號樹脂作用力減弱。

圖1 樣品溶液pH對吸附率的影響

3.4 吸附時間對吸附率的影響 圖2為吸附時間對吸附率的影響，由圖可見，隨著時間的延長，樹脂對哈巴俄苷的吸附率逐漸增大。0～20 h內，吸附率增長較快；20 h后，吸附率增長趨勢變緩；48 h時，吸附基本達到平衡狀態。由此可知，最佳靜態吸附時間為48 h。

圖2 吸附時間對吸附率的影響

3.5 乙醇體積分數對解吸率的影響 圖3為乙醇體積分數對解吸率的影響，由圖可見，該影響較大。乙醇體積分數小于50%時，解吸率隨乙醇體積分數的增大而上升，且上升趨勢較快；乙醇體積分數大于50%時，解吸率上升趨勢變緩；乙醇體積分數為80%時，解吸率最大，達93.02%；乙醇體積分數進一步增大時，解吸率緩慢降低。推測可能是由于哈巴俄苷等環烯醚萜類化合物具有一定極性，因而用極性越接近的溶劑洗脫，其解吸率越高，而且極性相差越大，其解吸率越小。這也從另一方面說明，80%左右的乙醇可能與哈巴俄苷極性相當。

圖3 乙醇體積分數對解吸率的影響

3.6 洗脫劑pH對解吸率的影響 圖4為洗脫劑pH對解吸率的影響，由圖可見，該影響較大，而且弱酸性物質易于被弱堿性介質洗脫。pH＜8時，解吸率隨pH的增大而上升；pH 8時，解吸率最大，達94.65%；pH＞8時，解吸率明顯降低，表明溶液的pH值直接影響弱酸性物質的存在形式和極性情況。另外圖4還顯示，80%的乙醇與pH 8時的哈巴俄苷等環烯醚萜類化合物的極性更為接近，因而解吸率更大。

圖4 洗脫劑pH對解吸率的影響

3.7 洗脫劑用量對解吸率的影響 圖5為洗脫劑用量對解吸量的影響，由圖可見，用量為0～3 BV時，解吸率的上升趨勢較快；用量為6 BV時，解吸率最大，可達到95.35%；用量進一步增大時，解吸率上升趨勢明顯變慢。綜合考慮目標產物的解吸率和洗脫劑的經濟成本等因素，本實驗選擇6 BV的洗脫劑用量。

4 討論

圖5 洗脫劑用量對解吸率的影響

綜合考慮5種大孔吸附樹脂對哈巴俄苷的吸附和解析性能時發現，HPD100樹脂最適宜用于分離純化玄參中的環烯醚萜，對哈巴俄苷的吸附率和解吸率可分別達到95.56%和90.46%。本實驗最佳工藝條件為：玄參樣品溶液pH為4，最佳靜態吸附時間為48 h，在此條件下對哈巴俄苷的吸附率為95.56%；洗脫劑為6 BV、pH為8的80%乙醇溶液，在此條件下對哈巴俄苷的解吸率可達到95.35%。

由此可見，HPD100型大孔吸附樹脂適宜用于分離純化玄參中的環烯醚萜類物質，而且適當調節樣品和洗脫劑的pH值，對吸附率和解吸率都有較大的提高。

［1］張劉強，李醫明.近10年玄參屬植物化學成分和藥理作用研究進展［J］.中草藥，2011，42（11）：2360-2368.

［2］姜守剛，蔣建勤，祖元剛.玄參的化學成分研究［J］.植物研究，2008，28（2）：254-256.

［3］胡瑛瑛，黃 真.玄參的化學成分及藥理作用研究進展［J］.浙江中醫藥大學學報，2008，32（2）：268-270.

［4］夏聰華，石森林，葛衛紅，等.玄參藥理活性研究進展［J］.中國藥師，2008，11（8）：911-913.

［5］鄭禮勝，劉向前.環烯醚萜類研究進展［J］.天然產物研究與開發，2009，21（4）：702-711.

［6］張靜澤，陳 虹，白淑芳.大孔吸附樹脂在中草藥活性成分研究中的應用［J］.遼寧中醫學院學報，2004，6（4）：290-291.

［7］何丙林，黃文強.離子交換與吸附樹脂［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1995.

［8］姚 干，何宗玉，方積年.大孔吸附樹脂純化梔子中總環烯醚萜苷和梔子苷的研究［J］.中草藥，2006，37（1）：57-59.

［9］李茂星，賈正平，胡之德.大孔樹脂富集純化藏藥獨一味總環烯醚萜苷［J］.中國中藥雜志，2007，32（17）：1743-1746.

［10］丁 霞，余宗亮，杜偉峰，等.SP825-大孔樹脂富集山茱萸環烯醚萜苷的工藝探索［J］.中成藥，2008，30（1）：53-56.

［11］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：108-109.

R284.2

：B

：1001-1528（2015）06-1367-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.049

2014-04-12

重慶市墊江縣“121”醫藥產業科技支持示范工程項目（Cstc2014zktjccxyyBX0025）

李祚丹（1989—），女，碩士，從事天然藥物提取研究。E-mail：danney5199@163.com

*通信作者：季金茍（1962—），男，教授，從事藥物化學研究。Tel：（023）65102531，E-mail：725_tiger@sina.com