CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及意義

李利義 羅越 劉海斌 韓紹偉 王飛海 鄭志強

CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及意義

李利義 羅越 劉海斌 韓紹偉 王飛海 鄭志強

目的 探討趨化性細胞受體因子4（CXCR4）、血管內(nèi)皮生長因子-C（VEGF-C）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用及意義。方法 應(yīng)用免疫組化法檢測76例人胃癌組織中CXCR4、VEGF-C和MMP-9的表達水平，并分析其與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果 CXCR4、VEGF-C或MMP-9任一指標表達水平與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著關(guān)系（均P＜0.01），且這3項指標兩兩相關(guān)，CXCR4/VEGF-C聯(lián)合陽性表達的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為84.8%（28/33），高于僅1項指標陽性表達（11/22，50.0%）及兩者聯(lián)合陰性表達（7/21，33.3%）的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；VEGF-C/MMP-9聯(lián)合陽性表達的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為80.0%（32/40），高于僅1項指標陽性表達（9/19，47.4%）及兩者聯(lián)合陰性表達（5/17，29.4%）的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或0.01）；CXCR4/MMP-9聯(lián)合陽性表達的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為83.3%（30/36），高于僅1項指標陽性表達（11/22，50.0%）及兩者聯(lián)合陰性表達（5/18，27.8%）的患者，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。3項指標共同表達的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高達90.0%。結(jié)論 CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，如果3項指標均為陽性者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性最大。

趨化性細胞受體因子4 血管內(nèi)皮生長因子-C 質(zhì)金屬蛋白酶-9 胃癌 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，居人類腫瘤相關(guān)致死率第2位[1]。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡最主要的原因，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是最常見的轉(zhuǎn)移方式，有研究證實淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素[2]。趨化性細胞受體因子4（chemokine CXC receptor 4，CXCR4）及其配體CXCLl2所構(gòu)成的信號傳導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)血細胞產(chǎn)生、造血細胞遷移及新生血管形成方面發(fā)揮了重要作用，與腫瘤特異性轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-5]。血管內(nèi)皮生長因子-C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）可以促進新生血管形成，而且可以促進淋巴管內(nèi)皮細胞增殖分化并誘導(dǎo)淋巴管生成。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是一種能降解細胞外基底膜及其它細胞外基質(zhì)成分的重要蛋白酶，具有促進腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的作用。為此，本研究應(yīng)用免疫組化方法檢測人胃癌組織中CXCR4、VEGF-C和MMP-9的表達水平，分析CXCR4、VEGF-C和MMP-9與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，探討它們在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用，以及三者表達的相關(guān)性和臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2009年12月至2010年12月在我院外科行手術(shù)治療的76例胃癌患者的手術(shù)切除組織標本；患者中男52例，女24例，年齡26～79歲，中位年齡60歲；所有患者術(shù)前均經(jīng)病理學(xué)檢查證實，均未接受放療或化療。腫瘤分期采用2010年國際抗癌聯(lián)盟頒布的胃癌TNM分期標準。每例患者于術(shù)后10min內(nèi)取組織標本，包括腫瘤組織及正常胃黏膜組織（距腫瘤組織邊緣5cm以上），并迅速置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑 兔抗人VEGF-C試劑盒為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，鼠抗人CXCR4抗體購自美國Sigma公司，兔抗人MMP-9抗體購自美國Epitomics公司，免疫組化S-P試劑盒購自德國寶靈曼公司。

1.3 方法 采用S-P法進行免疫組化染色。所有標本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后制備5μm厚連續(xù)切片。石蠟切片脫蠟，以微波枸櫞酸鹽進行抗原修復(fù)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明封片，顯微鏡下觀察，操作過程中嚴格質(zhì)控。用已知的陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 在組織切片中CXCR4、VEGF-C和MMP-9陽性細胞主要表現(xiàn)為細胞質(zhì)或(和)細胞膜染為棕黃色。免疫染色的結(jié)果由病理科醫(yī)生判定，每個樣本采用雙盲法計數(shù)10個高倍視野，評估陽性細胞率。陽性細胞數(shù)＜10%為陰性，≥10%為陽性，同時忽略較弱或可疑的染色。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。率的比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 CXCR4、VEGF-C或MMP-9單一表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 76例胃癌患者中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌組織中免疫組化染色陽性表達見圖1。CXCR4、VEGFC或MMP-9表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系見表1。

圖1 CXCR4（a）、VEGF-C（b）或MMP-9（c）在胃癌組織中陽性表達（免疫組化染色，×400）

表1 CXCR4、VEGF-C或MMP-9表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[例（%）]

由表1可見，在CXCR4、VEGF-C或MMP-9陽性表達的患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯高于陰性表達的患者（均P＜0.01），說明CXCR4、VEGF-C或MMP-9陽性表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

2.2 CXCR4、VEGF-C和MMP-9聯(lián)合表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 見表2。

由表2可見，CXCR4和VEGF-C均陽性表達的患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯高于該2項指標均陰性表達的患者；與僅有1項指標陽性表達的患者相比，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率也明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。同樣，VEGF-C和MMP-9或CXCR4和MMP-9均陽性表達的患者中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率均明顯高于該2項指標均陰性或僅有1項指標陽性表達的患者（P＜0.05或0.01）。這一結(jié)果提示，3項指標中任意2項陽性表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。進一步對CXCR4、VEGF-C和MMP-9這3項指標進行聯(lián)合分析，46例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，僅1項指標陽性表達的患者有5例，2項指標陽性表達的患者有12例，3項指標均陽性表達的患者有27例（90.0℅），3項指標均陰性表達的患者有2例，而在30例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，3項指標均陽性表達的患者僅有3例（10.0℅）；3項指標均陽性表達的患者其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯高于非3項指標均陽性表達的患者（P＜0.01）。以上結(jié)果表明：相比于0、1或2項指標陽性表達，3項指標共同陽性表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系更為密切。

表2 CXCR4、VEGF-C和MMP-9聯(lián)合表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系[例（%）]

2.3 CXCR4、VEGF-C和MMP-9表達的相互關(guān)系 相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中CXCR4的陽性表達與VEGF-C、MMP-9的陽性表達均呈顯著正相關(guān)（r=0.355、0.384，均P＜0.01），VEGF-C的陽性表達與MMP-9的陽性表達也呈顯著正相關(guān)（r=0.278，P＜0.05）。提示在胃癌的發(fā)展過程中，CXCR4、VEGF-C和MMP-9的高表達具有協(xié)同促進作用。

3 討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌最主要的轉(zhuǎn)移途徑，并且是胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素。因此，研究淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子機制，控制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，成為胃癌治療的重要環(huán)節(jié)，也可能為胃癌的藥物治療研究提供新的靶點。

CXCR4信號通路通過引導(dǎo)趨化和侵襲反應(yīng)在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到了至關(guān)重要的作用[6]。VEGF-C是腫瘤血管生成的重要調(diào)控因子[7]，并且可以通過與淋巴管內(nèi)皮細胞上的VEGF受體結(jié)合，增加淋巴管的通透性，促進淋巴細胞的增生，誘導(dǎo)淋巴管的生成[8]。MMP-9可以降解腫瘤的細胞外基質(zhì)，破壞基底膜，促進新生血管生成。基底膜的降解和新生血管的形成共同促使腫瘤細胞進入循環(huán)，通過CXCR4-CXCLl2生物學(xué)軸的趨化作用，使腫瘤細胞在靶器官被俘獲，在靶器官再通過VEGF和MMP-9引起血管新生、基底膜降解，并協(xié)同其他因子最終導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。

本研究通過免疫組化方法分析了胃癌中CXCR4、VEGF-C和MMP-9的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4、VEGF-C或MMP-9的陽性表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。進一步研究表明，聯(lián)合評估這些標記物的表達可能可以用于預(yù)測胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。

最近的研究證實：通過CXCL12刺激趨化因子受體CXCR4表達或通過轉(zhuǎn)導(dǎo)，使人類腫瘤細胞系CXCR4過表達，可以增加VEGF的異常表達和新生血管形成[9-10]。趨化因子受體CXCR4與其配體CXCL12相互作用，然后通過誘導(dǎo)VEGF介導(dǎo)的血管再生可能促進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移。由此我們推斷：CXCR4和VEGF的表達水平可能是合適的預(yù)測腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力的生物學(xué)指標。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)胃癌中CXCR4和VEGF-C的表達具有顯著相關(guān)性。此外，與僅1項指標陽性表達的患者相比，CXCR4和VEGF-C聯(lián)合陽性表達的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，CXCR4和VEGF-C表達的變化可能在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用。

由CXCL12-CXCR4軸介導(dǎo)的癌細胞至靶器官的趨化作用需要細胞遷移通過基底膜，但CXCL12和CXCR4不能單獨介導(dǎo)這一過程。有趣的是，MMP-9在細胞外基質(zhì)降解及促進內(nèi)皮細胞遷移通過基底膜的過程中能發(fā)揮重要的作用[11]。體外試驗表明：CXCL12-CXCR4相互作用可以增加多種腫瘤細胞系MMP-9的分泌，包括頭頸部鱗狀細胞癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌[12-13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CXCR4和MMP-9的表達顯著相關(guān)，表明CXCR4的異常表達可能導(dǎo)致胃癌中MMP-9的超表達。我們還發(fā)現(xiàn)，與單一指標陽性表達的患者相比，CXCR4和MMP-9聯(lián)合陽性表達的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著增加。這一證據(jù)表明，CXCR4和MMP-9的聯(lián)合表達至少在一定程度上可能導(dǎo)致胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但需要更多的研究來分析CXCR4介導(dǎo)的信號通路導(dǎo)致MMP-9激活的機制，以及它們在胃癌發(fā)展中的協(xié)同作用。

Sweeney等[143]利用特定抗VEGF抗體治療前列腺癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)皮細胞中MMP-9的產(chǎn)生明顯減少，因此我們推斷：MMP-9與VEGF的表達有內(nèi)在聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示，胃癌中VEGF-C和MMP-9的表達有顯著的相關(guān)性；VEGF-C和MMP-9聯(lián)合陽性表達的患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率顯著增加。以上結(jié)果提示VEGF-C和MMP-9在介導(dǎo)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面具有協(xié)同效應(yīng)，其聯(lián)合表達可能是胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要預(yù)測指標。

總之，目前的研究表明CXCR4、VEGF-C和MMP-9在胃癌組織中高度表達[15]，而且它們的表達具有顯著相關(guān)性。任一指標的獨立表達與胃癌進展相關(guān)，3項指標中的任意2項聯(lián)合表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)；與0、1或2項指標陽性表達相比，3項指標共同表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系更為密切。因此，CXCR4、VEGF-C和MMP-9共同表達可能是胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有價值的預(yù)測指標，三者的協(xié)同作用可能促進腫瘤血管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，抑制三者的表達可能是胃癌一種有效的輔助治療方法。

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Correlation of CXCR4,VEGF,MMP-9 expression w ith lymphatic metastasis in gastric cancer

LI Liyi,LUO Yue,LIU Haibin,et al.
Department of General Surgery,the Second Affiliated Hospital ofWenzhou Medical University,Whenzhou 325027,China

Objective To investigated the association of CXCR4,VEGF-C,MMP-9 exp ression with lymphatic metastasis in gastric cancer.Methods The exp ressions of CXCR4,VEGF-C and MMP-9 were detected by immuohistochem istry in 76 samp les of gastric cancer.The relationship between these markers and lymph node metastasis of gastric cancerwas analyzed.Results The exp ression of CXCR4、VEGF-C and MMP-9 was significantly associated with lymph node metastasis in gastric cancer(P＜0.01).The exp ressions of three p roteins were significantcorrelated w ith each other.Rate of lymph nodemetastasis in patients w ith exp ression of both CXCR4 and VEGF-C was 84.5%(28/33),which was significantly higher than that in patients w ith sing le p rotein exp ression(11/22,50.0%)or in those with negative exp ression(7/21,33.3%).Sim ilarly,the rate in patients w ith both VEGF-C and MMP-9 exp ression was 80.0%(32/40),which was higher than that in patients w ith sing le p rotein positive exp ression(9/19,47.4%),or in those w ith negative exp ression(5/17,29.4%).The rate in patients w ith both CXCR4 and MMP-9 exp ression was 83.3%(30/36),which was higher than that in patients w ith sing le p rotein positive exp ression(11/22,50.0%),or in those w ith negative exp ression(5/18,27.8%).The d ifferences were all found to be statistically significant(P＜0.01).The rate of lym ph nodemetastasis in patients w ith exp ression ofall three p roteins was 90.0%(27/30).Conclusion The exp ression of CXCR4, VEGF-C and MMP-9 is c losely correlated w ith lym ph nodemetastasis in gastric cancer,patients w ith positive exp ression of three markers aremost likely to have lym ph nodemetastasis.

CXCR4 VEGF-C MMP-9 Gastric cancer Lym phatic metastasis

2013-06-06）

（本文編輯：沈叔洪）

溫州市科技計劃基金（Y20090061）

325027溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院胃腸外科