不同分期胃腺癌及癌旁組織蛋白質表達譜的研究

褚美芬 陳毓 郭劍民 吳怡春

不同分期胃腺癌及癌旁組織蛋白質表達譜的研究

褚美芬 陳毓 郭劍民 吳怡春

目的鉬建立II、IV期胃腺癌及癌旁胃組織的蛋白質表達譜并分析其表達的差異。方法鉬從胃腺癌II期和IV期患者各3例提取胃癌組織（CaII和CaIV）及胃旁組織（PII和PIV）中總蛋白，采用雙向凝膠電泳獲得CaII、CaIV、PII、PIV胃組織蛋白質表達譜，通過基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜（MALDI-TOF/TOF）對主要差異蛋白進行分析。 結果 PII與CaII之間蛋白質表達有顯著差異（達2.0倍以上）的蛋白點有28個，CaII3個蛋白點表達上調，25個蛋白點表達下調；PIV與CaIV之間蛋白質表達有顯著差異（達2.0倍以上）的蛋白點有25個，CaIV這些蛋白點表達均下調。使用MALDI－TOF/TOF質譜成功鑒定到8個蛋白點在CaII和CaIV中的表達與PII、PIV均有顯著差異，分別是谷胱甘肽巰基轉移酶、內質網蛋白ERP29、SH3P、蛋白質膜聯蛋白A4、肝臟型脂肪酸結合蛋白、磷酸丙糖異構酶、Transgelin和磷脂酰乙醇結合蛋白，這些蛋白大多與細胞增殖、細胞凋亡及信號轉導相關。 結論 不同分期胃癌與其癌旁組織之間存在蛋白質表達差異，有助于從分子水平了解胃癌的發病機制，探索新的胃癌相關標志物和基因治療靶點。

胃腺癌 蛋白質組學 雙向凝膠電泳 MALDI-TOF/TOF

【 Abstract】 Objective To analyze protein profiles in gastric carcinoma with different stages. Methods The total proteins were extracted from specimens of gastric carcinoma TNM stage II and VI(CaII,CaIV)and corresponding pericancerous gastric tissue(PII,PIV).The proteins were separated by two-dimensional gel electrophoresis(2-DE)and analyzed by laser desorption ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF). Results There were 28 significantly spots between PII and CaII(＞2.0),among which 3 spots were up-regulated and 25 spots were down-regulated in CaII;25 significantly spots were found between PIV and CaIV(＞2.0),all of which were down-regulated in CaIV.Eight spots in gastric carcinoma tissue were identified by MALDI TOF/TOF mass spectrometry.Glutathione S-transferase,ERP29,SH3P,Annexin A4,liver fatty acid binding protein,triosephosphate isomerase isoform 2,transgelin and phosphatidylethanolamine-binding protein 1 were identified in both CaII and CaIV,compared with the corresponding pericancerous tissue. Conclusion Protein expressions are different between gastric cancer tissue and the corresponding pericancerous tissue.

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一[1]。每年胃癌新發病例大約為100萬人，死亡病例87萬人。據統計，大約有2/3的胃癌病例發生在發展中國家，是中國發病率較高的惡性腫瘤之一[2]。蛋白質組學是后基因組時代對蛋白質組研究和探索的一個新的領域，它主要是通過對蛋白質水平上細胞基因表達終產物進行定性和定量分析來揭示生命活動的過程和基因表達的調控機制[3]。很多研究已經證明蛋白質組學在惡性腫瘤研究中有顯著的臨床意義[4-5]。近幾年，蛋白質組學在胃癌中也有較廣泛的研究[6]。本研究擬采用傳統雙向凝膠電泳技術對胃癌不同分期組織蛋白質表達譜進行比較分析，再通過基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜（MALDI-TOF/TOF）對主要差異蛋白進行分析，所得結果與蛋白質組數據庫進行比對分析確定差異表達蛋白質，建立蛋白差異表達譜，以期為揭示差異表達蛋白質在不同時期胃腺癌動態變化規律及其內在聯系提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本 胃癌組織及癌旁組織樣本來自2013年10～12月浙江省腫瘤醫院外科手術患者，均為男性，年齡53～65歲。根據TNM分期標準，經病理及免疫組化證實為Ⅱ期和Ⅳ期胃腺癌各3例。癌旁組織分別為癌灶周圍5cm以外胃黏膜組織，均經病理證實無癌細胞侵潤。6例患者均自愿入組并簽署相關知情同意書。

1.1.2 試劑和儀器 NP-40、β-巰基乙醇、蛋白酶抑制劑cocktail、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺、尿素、硫脲、CHAPS、瓊脂糖、溴酚藍、考馬斯亮藍、兩性電解質載體、ImmobilineTM干膠條（13cm，pH3～10）、Bradford protein assay reagent均為美國GE Healthcare公司產品；Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺均為德國Amresco公司產品。EttanTMIPGphor3TM等電聚焦儀、SE600Ruby標準垂直電泳槽、圖像分析軟件ImageMaster 2D Platinum 6.0均為美國GE Healthcare產品；UMax Powerlook 2110XL掃描儀為美國GE Amersham公司產品；4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer為美國Applied Biosystems公司產品。

1.2 方法

1.2.1 組織標本的處理 無菌條件下切取手術后新鮮標本，用0.9%氯化鈉溶液多次沖洗以去除血液并盡量切除結締組織及壞死組織，處理后的樣品立即置于-80℃凍存備用。

1.2.2 組織總蛋白的提取 將組織標本100mg快速浸于液氮之中充分研磨直至粉末狀后，用1ml 2D裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，40mmol/L Tris，0.5%TritonX-100，65mmol/L DTT，0.5%兩性電解質載體pharmalyte）裂解后加入蛋白酶抑制劑（Cocktail）。冰浴超聲裂解（80W，10次，每次10s，間隔15s，冰上完成）超聲后離心12 000×g，45min，4℃，取上清液，加丙酮沉淀過夜，離心，棄上清液，用丙酮洗3次，晾干，加適量2D裂解液溶解沉淀，使用Bradford protein assay reagent測定蛋白質濃度，分裝，置于-80℃保存備用。

1.2.3 雙向凝膠電泳 第一向等點聚焦（IEF）：采用13cm pH3～10的固相干膠條。樣品和水化液共250μl用于IPG膠條上樣，室溫下吸脹過夜。等點聚焦使用Ettan IPGphor 3等點聚焦儀進行，運行參數如表1。聚焦結束后，將膠條置于平衡液I（6M尿素，pH8.8的50mM Tris-HCl，30%甘油，4%SDS，1%DTT）中平衡15min，然后在平衡液Ⅱ（6M尿素，pH8.8的50mM Tris-HCl，30%甘油，4%SDS，2.5%碘代乙酰胺）中平衡15min后轉移至第二向進行分離。第二向 SDS-PAGE在SE600Ruby標準垂直電泳槽上進行，采用聚合度12.5%的分離膠濃度。

表1 IEF參數設置

1.2.4 凝膠染色并掃描分析 電泳結束取下凝膠，銀染顯色后用UMax Powerlook 2110XL掃描儀掃描凝膠，ImageMaster 2D Platinum 6.0膠圖像分析軟件依次對兩組樣品進行點檢測、背景消減、均一化、建立平均凝膠，匹配、量化獲取斑點的相關信息并對兩組樣品分別進行t-test分析，如果表達量差距在2.0倍以上則視為存在明顯的差異表達并得出差異表達蛋白點的具體數據。

1.2.5 差異蛋白點的質譜鑒定 用槍頭將選取的差異蛋白質斑點從預制膠上取下，超純水洗滌3次，按50μl/蛋白點依次加入工作液Ⅰ[30mmol/L K3Fe（CN）6]和Ⅱ（100mmol/L Na2S2O3），1∶1混合，振蕩搖勻，洗至蛋白質點顏色消失，去除上清液，用超純水漂洗數次終止反應。終止后，加入溶液（Ⅲ200mmol/L NH4HCO3）靜置20min，吸取上清液，純水漂洗數次終止反應，反復加入乙氰使膠脫水至白色，真空干燥凍干。凍干后，加入酶解緩沖液Ⅳ（10ng/μl Trypsin，50mmol/L NH4HCO3，pH8.0），37℃孵育過夜。酶解后，加入10～20μl溶液V（50%乙氰（Acetonitrile，CAN），0.1% 三氟乙酸 （Trifluoroacetic acid，TFA），超聲15min，抽提肽片段，將抽提液真空干燥，凍干。凍干的樣品用0.1%TFA復溶，通過C18 ZipTip（Millipore，Bedford，MA）進行脫鹽，基質選用5mg/ml的α-4-羥基肉桂酸（α-4-hydroxy cinnamic acid，CHCA）溶解在0.1%TFA和50%ACN中，進行質譜分析，利用MASCOT在NCBI蛋白質網站數據庫中進行檢索。

2 結果

2.1 雙向凝膠電泳 分別對Ⅱ期癌旁組織（PⅡ）和Ⅱ期胃癌組織（CaⅡ）、Ⅳ期癌旁組織（PⅣ）和Ⅳ期胃癌組織（CaⅣ）進行3次重復雙向凝膠電泳，PⅡ和CaⅡ，PⅣ和CaⅣ的蛋白雙向電泳凝膠圖見圖1。利用Image-Master 2D Platinum 6.0膠圖像分析軟件進行分析，兩兩比較后發現，PⅡ與CaⅡ之間蛋白質表達有顯著差異（達2.0倍以上，P＜0.05）的蛋白點有28個，CaⅡ3個蛋白點表達上調，25個蛋白點表達下調；PⅣ與CaⅣ之間蛋白質表達有顯著差異（達2.0倍以上，P＜0.05）的蛋白點有25個，CaⅣ這些蛋白點表達均下調。部分差異蛋白點在PⅡ與CaⅡ及PⅣ與CaⅣ組織中兩兩比對放 大圖譜如圖2所示。

圖1 胃腺癌組織蛋白質雙向凝膠電泳圖譜

圖2 部分胃癌組織雙向凝膠電泳放大圖譜（A：PⅡ和CaⅡ差異表達蛋白；B：PⅣ與CaⅣ差異表達蛋白）

2.2 差異蛋白點的質譜鑒定 切取在CaⅡ和CaⅣ中表達差異2.0倍以上的蛋白點44個，使用MALDI TOF/ TOF質譜成功鑒定到38個蛋白點，鑒定成功率95%。經MASCOT搜索NCBI數據庫后發現有8個蛋白在Ⅱ期和Ⅳ期胃癌組織中均有顯著差異表達，見表2。結果顯示，谷胱甘肽巰基轉移酶（spot 1400）、內質網蛋白ERP29（spot 1441）、SH3P（SH3 domain-binding glutamic acid-rich-like protein，spot 1874）、蛋白質膜聯蛋白A4（ANXA4，sopt 1316）、肝臟型脂肪酸結合蛋白（spot1892）、磷酸丙糖異構酶（spot 1503）、Transgelin（spot 1593）及磷脂酰乙醇結合蛋白（spot 1618）在CaⅡ和CaⅣ胃癌組織中均比其對應的PⅡ和PⅣ中顯著下調；其中谷胱甘肽巰基轉移酶、內質網蛋白ERP29、SH3P在CaⅡ和CaⅣ中下調表達幅度基本一致；而蛋白質膜聯蛋白A4、脂肪酸結合蛋白在CaⅣ中下調幅度更大；磷酸丙糖異構酶、轉凝蛋白、磷脂酰乙醇結合蛋白在CaⅡ中的表達下調更顯著。

3 討論

近年來通過蛋白質組學尋找分子標記物來治療胃癌越來越受到研究者的重視[7-8]。本研究運用傳統的雙向凝膠電泳技術建立了人CaⅡ和CaⅣ蛋白差異圖譜，并用ImageMaster 2D Platinum 6.0膠圖像分析軟件找出在CaⅡ和CaⅣ中均有差異蛋白點，并對其進行質譜鑒定。通過初步探討，發現這些差異表達蛋白與胃癌細胞信號傳導、維持細胞形態及正常防御功能、促進細胞分裂增殖及細胞凋亡等有關。

谷胱甘肽巰基轉移酶（GSTs）是人體內生物轉化最重要的Ⅱ相代謝酶之一，是細胞抗氧化損傷、抗癌變的主要解毒酶，與人類腫瘤關系密切[9-10]。有研究顯示，GSTs-π在胃癌組織中呈高表達，GSTs-π的過度表達有利于細胞內解毒，但同時也促進細胞分化進而促進細胞癌變[11]。本研究中GSTs在CaⅡ和CaⅣ中均表達下調，這可能由于GSTs低表達導致解毒功能降低從而增加了胃癌的發生。

表2 差異蛋白質譜鑒定結果

近年來，研究者們發現內質網分子伴侶（ERP29）在多種腫瘤如乳腺癌、肝癌、結直腸癌等中表達下調，具有抑癌基因的作用，與腫瘤細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡密切相關，對于腫瘤的診斷、治療和預后具有重要意義[12]。近期，有研究發現ERP29在胃癌組織中也下調表達[13]，但是關于ERP29在胃癌中的具體機制依然不清楚。本研究結果顯示：ERP29在CaⅡ和CaⅣ中均表達下調，這可能是胃癌細胞由于缺氧、營養物質缺乏等微環境改變，參與啟動細胞防衛性反應的ERP29表達下調，不能有效消除內質網應激反應，從而導致胃癌的進一步發生。

SH3LP是谷胱甘肽依賴的氧化還原酶超級家族成員。有研究顯示，SH3LP在大腦多形性膠質母細胞瘤中表達上調[14]。然而，本研究結果顯示：SH3LP在CaⅡ和CaⅣ中均表達下調，這可能是由于SH3LP的下調表達引起細胞內活性氧水平下降，影響細胞凋亡的進程[15]，進而促進癌細胞的增殖。

ANXA4，是細胞內的Ca2+傳感器，最初在上皮細胞中發現，并且參與細胞凋亡、細胞周期和抗凝各種生物進程[16]。在胃癌細胞中，ANXA4觸發信號級聯，導致上皮細胞增殖的增加，最終促進癌變[17]。但是當腫瘤出現向外侵襲時，瘤內的ANXA4的表達反而下調[18]。本研究中ANXA4在CaⅡ和CaⅣ中均表達下調，且在Ⅳ期胃癌組織中表達下調更顯著。提示Ⅳ期胃癌患者，腫瘤可能已經開始出現向外侵襲的現象，其臨床意義及機制仍需進一步研究。

脂肪酸結合蛋白是細胞內脂肪酸載體蛋白，其在細胞內利用脂肪酸發揮著重要作用，主要參與胞內長鏈脂肪酸的攝取、轉運、代謝調節以及保護細胞免受游離脂肪酸毒性反應[19]。在長沙鼠胃癌模型的蛋白質組學研究[20]及DNA芯片技術篩選胃癌基因的研究[21]中均發現脂肪酸結合蛋白表達下調，這與我們的研究結果一致，而且本次研究還發現在Ⅳ期胃癌組織中其表達下調更明顯。這提示，可能隨著癌細胞增殖，脂肪酸結合蛋白表達下降，不能及時清除游離脂肪酸毒性，同時抑制細胞凋亡的發生。

磷酸丙糖異構酶是糖酵解途徑中的關鍵酶。研究顯示，部分糖酵解關鍵酶在腫瘤中除了參與葡萄糖代謝以外，還能夠促進惡性腫瘤增殖、抵抗癌細胞死亡，具有促癌作用[22]。本研究結果顯示：該蛋白在CaⅡ和CaⅣ中均表達下調，但與CaⅡ相比，在CaⅣ中的表達比CaⅡ中略有上調。我們推測磷酸丙糖異構酶在胃癌組織中表達下調導致能量代謝受阻，之后隨著腫瘤的增殖，抵抗癌細胞死亡能力減弱，導致其在Ⅳ期癌組織中的表達出現一定程度的上調。這需要我們進一步的驗證。

Transgelin是一種MMP-9表達的轉錄調控因子，通過ERK激活受損的方式降低AP-1依賴的反式活化從而抑制MMP-9表達[23]。研究顯示，Transgelin在胃癌組織中過表達[24]，但具體與胃癌發生、發展機制尚不清楚。本研究結果顯示：Transgelin在CaⅡ和CaⅣ中均下調表達，然而相比CaⅡ，該蛋白在CaⅣ中表達略有上調。可能是隨著癌癥進展，Transgelin又再次被激活從而導致其蛋白表達上調，推測transgelin的表達降低可能是在這些胃癌組織中MMP-9表達增加而造成的，這需要在以后的研究工作中進一步證實。

磷脂酰乙醇胺結合蛋白（PEBP）在腫瘤領域的臨床研究價值得到了越來越多的支持和認可[25]。最近研究顯示，誘導胃癌發生的幽門螺桿菌能夠促進蛋白酶體介導的PEBP1的降解以及PEBP1轉錄抑制因子Snail的表達[26]。本研究結果顯示：PEBP在CaⅡ和CaⅣ中均下調表達，提示胃癌的發生與PEBP之間存在一定的聯系，但是具體機制仍需要進一步研究。

綜上所述，本研究通過對CaⅡ和CaⅣ組織以及癌旁組織進行蛋白質組學分析，獲得一定數量蛋白質表達譜數據。在CaⅡ和CaⅣ中發現多個蛋白參與到細胞信號轉導、細胞增殖以及細胞凋亡過程中，為揭示差異表達蛋白在不同時期胃腺癌動態變化規律及其內在聯系提供一定依據，但仍然需要大量樣本進行進一步研究證實。

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（本文編輯：沈昱平）

《浙江醫學》對圖表的要求

稿件中若有圖表，分別按其在正文中出現的先后次序連續編碼。每幅圖應冠有圖題。說明性的文字應置于圖下方注釋中，并在注釋中標明圖表中使用的全部非公知公用的縮寫。線條圖應墨繪在白紙上，高寬比例以5∶7為宜。以計算機制圖者應提供激光打印圖樣。照片圖要求有良好的清晰度和對比度；圖中需標注的符號（包括箭頭）請用另紙標上，不要直接寫在照片上。每幅圖的背面應貼上標簽，注明圖號、方向及作者姓名。若刊用人像，應征得本人的書面同意，或遮蓋其能被辨認出系何人的部分。大體標本照片在圖內應有尺度標記。病理照片要求注明染色方法和放大倍數。圖表中如有引自他刊者，應注明出處。電子版投稿中圖片建議采用JPG格式。表格建議采用三橫線表（頂線、表頭線、底線），如遇有合計和統計學處理內容（如t值、P值等），則在此行上面加一條分界橫線；表內數據要求同一指標有效位數一致，一般按標準差的1/3確定有效位數。

本刊編輯部

Proteomic analysis of gastric cancer with different stages

CHU Meifen,CHEN Yu,GUO Jianmin,et al.Department of Laboratory Medicine,Zhejiang Medical College,Hangzhou 310053,China

Gastric cancerProteomics Two-dimensional gel elctrophresis MALDI-TOF/TOF

2015-04-24）

浙江省醫藥衛生科技計劃（2013KYA047）

310053 杭州，浙江醫學高等專科學校檢驗系（褚美芬、陳毓、吳怡春）；浙江省腫瘤醫院腹部外科（郭劍民）

吳怡春，E-mail：wuyichun1@yeah.net