毛蒟揮發(fā)油測(cè)定及其貯存期考察

謝鳳鳳， 曾錦燕， 曾祥燕， 蔡 毅

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001）

毛蒟揮發(fā)油測(cè)定及其貯存期考察

謝鳳鳳， 曾錦燕， 曾祥燕， 蔡 毅*

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530001）

目的水蒸汽蒸餾法提取廣西產(chǎn)毛蒟中揮發(fā)油，GC-MS法測(cè)定揮發(fā)油中β-石竹烯含有量，并對(duì)其最佳貯存期進(jìn)行考察。方法揮發(fā)油的分析色譜柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25μm）；程序升溫；載氣為氦氣；水楊酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物。結(jié)果揮發(fā)油得油率在0.23%～1.64%之間，貯存1年后其下降率為22.68%，1.5年后下降率為41.63%；β-石竹烯在0.033 9～0.542 4μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系 （r=0.999 6），平均回收率為98.5% （RSD= 2.0%，n=6）；β-石竹烯含有量在31.363 8～338.957 2 mg/mL之間，一年后其下降率為35.03%，一年半后下降率為44.53%。結(jié)論建議毛蒟的貯存時(shí)間不超過(guò)1年。

毛蒟；揮發(fā)油；β-石竹烯；GC-MS；貯存期

毛蒟來(lái)源于胡椒科植物毛蒟Piper puberulum（Benth.）Maxim.全草，異名小毛蒟、小墻風(fēng)、野蘆子，為廣西民間常用中草藥［1］，主產(chǎn)于廣西、廣東、南海各沿海島嶼［2］，具有祛風(fēng)驅(qū)寒除濕，行氣活血止痛功效，主治風(fēng)濕性腰痛、跌打損傷、脘腹疼痛等［3］。其氣味濃烈，富含揮發(fā)油，而且其中非萜類(lèi)成分 （尤其芳香族化合物）的比例較大［4］?，F(xiàn)代研究表明，毛蒟具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛和抗血小板聚集等藥理作用［5-6］。本實(shí)驗(yàn)在完成生藥鑒別［7-8］、揮發(fā)油成分［9］、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)初步研究［10］等工作的基礎(chǔ)上，對(duì)產(chǎn)于廣西各地毛蒟的揮發(fā)油及其中β-石竹烯含有量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其貯存期進(jìn)行考察，為該植物進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

6890N-5973N型GC-MS聯(lián)用儀（美國(guó)Agi1ent公司）；BP211D電子天平 （德國(guó)賽多利斯公司）；HDM 2000型調(diào)溫恒溫電熱套 （常州國(guó)華電器有限公司）；L16875B移液槍?zhuān)ǖ聡?guó)Eppendorf公司）。

毛蒟采自廣西各地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)蔡毅教授鑒定為胡椒科植物毛蒟Piper puberulum（Benth.）Maxim.全草。β-石竹烯對(duì)照品（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)22075-1MJ-F）。水楊酸甲酯和乙酸乙酯均為分析純 （國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油的提取 分別取各批次毛蒟藥材110 g，剪成約1 cm小段，置于2 000 m L圓底燒瓶中，水蒸汽蒸餾法提取5 h。按2010年版 《中國(guó)藥典》一部附錄XD揮發(fā)油測(cè)定法測(cè)定，收集揮發(fā)油，無(wú)水硫酸鈉干燥，離心10 min，得到毛蒟揮發(fā)油樣品。所得揮發(fā)油體輕，浮于水面，氣味濃烈。

2.2 內(nèi)標(biāo)物溶液的配制 精密量取水楊酸甲酯200μL，稱(chēng)重242.35 mg，乙酸乙酯定容至10 mL，搖勻，質(zhì)量濃度為24.235 mg/mL，即得內(nèi)標(biāo)物溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的配制 精密量取β-石竹烯對(duì)照品36μL，稱(chēng)重33.9 mg，加內(nèi)標(biāo)溶液10μL，乙酸乙酯定容至10 mL，搖勻，即得對(duì)照品溶液 （β-石竹烯質(zhì)量濃度為3.390 mg/mL）。

2.4 供試品溶液的制備 精密量取不同產(chǎn)地毛蒟揮發(fā)油樣品6μL，置于2 m L量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液10μL，乙酸乙酯定容，即得供試品溶液。

2.5 色譜條件 HP-5MS石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；程序升溫，初始溫度60℃，保持2 min，然后以10℃/min的速率升至110℃，并保持15 min，再以2℃/min的速率升至116℃，并保持6 min，隨即以10℃/min的速率升至140℃，并保持8 min，最后以5℃/min的速率升至260℃，并保持2 min；載氣為氦氣（He）；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃；檢測(cè)器溫度280℃；溶劑延遲3 min；進(jìn)樣量0.4 μL；分流比1∶1。

2.6 質(zhì)譜條件 電離方式EI；電子能量70 eV；四級(jí)桿溫度150℃；倍增電壓1 247 eV；接口溫度280℃；掃描范圍m/z 45～550。然后，分別對(duì)對(duì)照品和供試品溶液 （MJ-4）進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系的考察 精密移取對(duì)照品溶液0.05、0.1、0.4、0.6、0.8 mL，置于2 m L量瓶中，分別按 “2.3”項(xiàng)下方法配制對(duì)照品溶液。再各取0.4μL進(jìn)樣，在 “2.5”項(xiàng)條件下進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)濃度之比為X，對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為Y，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y= 1.367 0X+0.124 8（r=0.999 6），β-石竹烯在0.033 9～0.542 4μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.7.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取質(zhì)量濃度為0.169 5 mg/mL的β-石竹烯對(duì)照品溶液0.4μL，在“2.5”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積值，計(jì)算出RSD為2.06%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密移取毛蒟供試品溶液（MJ-4）6份，各6μL，分別按 “2.4”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下分析，計(jì)算出RSD為3.00%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取同一份供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣0.4μL，在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下分析，測(cè)定峰面積值，計(jì)算出RSD為2.07% （n=6），表明樣品在10 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.7.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取對(duì)照品28.85 mg，定容至2 mL；精密移取毛蒟揮發(fā)油樣品溶液 （MJ-4）3μL，各6份；精密移取質(zhì)量濃度為14.425 mg/mL的對(duì)照品溶液10μL（0.144 3 mg），分別加入6份揮發(fā)油樣品溶液，按 “2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，β-石竹烯進(jìn)樣量在0.112 7～0.115 2μg之間，在線性范圍之內(nèi)，平均回收率為98.5%，RSD為2.0%（n=6），說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度高，可作為毛蒟揮發(fā)油中β-石竹烯的測(cè)定方法，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.8 樣品測(cè)定 精密移取不同批次的毛蒟揮發(fā)油供試品，各6μL，按 “2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。再精密吸取0.4μL，注入氣質(zhì)聯(lián)用儀，在“2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各產(chǎn)地毛蒟揮發(fā)油中β-石竹烯含有量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 9批毛蒟樣品中揮發(fā)油得油率與β-石竹烯的含有量Tab.2 Volatile oil yields and contents ofβ-caryophyllene in 9 batches of Piper puberulum

2.9 考察不同貯存期對(duì)毛蒟揮發(fā)油的影響

2.9.1 揮發(fā)油得油率的變化 將上述毛蒟 （產(chǎn)地MJ-1～MJ-5）貯存一年及一年半后，取各產(chǎn)地藥材100 g，按照 “2.1”項(xiàng)下方法提取揮發(fā)油。結(jié)果，一年后所得的揮發(fā)油體輕，浮于水面，與新鮮時(shí)相比，氣味較淡、顏色偏深，而一年半后所得揮發(fā)油性狀與一年后變化不大，5個(gè)產(chǎn)地?fù)]發(fā)油得油率的變化見(jiàn)表3。

表3 不同貯存期下毛蒟揮發(fā)油得率的變化Tab.3 Change of volatile oil yields of Piper puberulum during different storage times

2.9.2 β-石竹烯含有量的變化 將“2.9.1”項(xiàng)下得到的揮發(fā)油在 “2.5”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得β-石竹烯含有量變化，見(jiàn)表4。

表4 不同貯存期下β-石竹烯的含有量變化Tab.4 Change ofβ-caryophyllene contents during different storage times

3 討論

揮發(fā)油是一類(lèi)由萜類(lèi) （單萜和倍半萜）、芳香族、脂肪族成分等組成的復(fù)雜化合物，常存在于具有明顯氣味的藥材中，具有發(fā)散解表、芳香開(kāi)竅、理氣止痛、祛風(fēng)除濕等作用，對(duì)心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)等多方面疾病都具有療效［11-13］。毛蒟具有祛風(fēng)散寒除濕，行氣活血止痛功效，其有效成分可能就是揮發(fā)油。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地毛蒟揮發(fā)油中均含β-石竹烯，可作為控制其質(zhì)量的指標(biāo)性成分。

本實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法，對(duì)毛蒟揮發(fā)油中的β-石竹烯進(jìn)行定量測(cè)定。在考察萘與水楊酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物時(shí)發(fā)現(xiàn)，水楊酸甲酯峰型好，對(duì)其他峰均無(wú)干擾，故選用水楊酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)物，避免了因手動(dòng)進(jìn)樣而導(dǎo)致的誤差，確保其含有量測(cè)定的準(zhǔn)確度。

從上述結(jié)果得出，各產(chǎn)地毛蒟揮發(fā)油的得油率在0.23%～1.64%之間，相差較大；β-石竹烯的含有量在31.3638～338.9572 mg/m L之間，差異也較大，而且與得油率不呈正比關(guān)系，均受產(chǎn)地、采收季節(jié)、貯藏時(shí)間等因素影響。

毛蒟屬于胡椒科植物，揮發(fā)油含有量較高，在貯存一年后，其得油率下降了22.68%，β-石竹烯含有量下降了35.03%；一年半后，得油率下降了41.63%，含有量下降了44.53%。由于一年半內(nèi)得油率與β-石竹烯含有量均迅速下降過(guò)半，故建議毛蒟貯存期為一年，且貯存時(shí)注意密閉避光。

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Determ ination of volatile oil in Piper puberulum and its proper storage tim e

XIE Feng-feng， ZENG Jin-yan， ZENG Xiang-yan， CAIYi*

（Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China）

AIMTo determineβ-caryophy11ene content in vo1ati1e oi1 iso1ated from Piper puberulum by GCMS choose its proper storage time.M ETHODSThe ana1ysis of vo1ati1e oi1was performed on HP-5MS（30 m× 0.25 mm，0.25μm）co1umn with temperature-programming mode，carrier gas was He，and interna1 standard substance wasmethy1sa1icy1ate.RESULTSVo1ati1e oi1rate was between 0.23%and 1.64%.A year 1ater，its drop rate was 22.68%.After a year and a ha1f，itwas41.63%.There was a good 1inear re1ationship forβ-caryophy11ene during 0.033 9-0.542 4μg（r=0.999 6），the average recovery ratewas98.5%（RSD=2.0%，n= 6），the content ofβ-caryophy11ene was 31.363 8-338.957 2 mg/mL.A year 1ater，its drop rate was 35.03%. After a year and a ha1f，it was 44.53%.CONCLUSIONIt suggests that the storage time of P.puberulum shou1d be no 1ess than one year.

Piper puberulum；vo1ati1e oi1；β-caryophy11ene；GC-MS；storage time

R284.1

A

1001-1528（2015）08-1776-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.08.031

2014-11-04

廣西自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目 （2011GXNSFF018006）；廣西 “2011協(xié)同創(chuàng)新中心”-壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目 （桂教科研 ［2013］20號(hào)）；壯藥毛蒟質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目 （MZY2013063）；廣西壯瑤藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) （桂科基字 ［2014］32號(hào)）；廣西重點(diǎn)學(xué)科 （壯藥學(xué)）（桂教科研 ［2013］16號(hào)）

謝鳳鳳 （1989—），女，碩士，主要從事中藥及民族藥品種鑒別與開(kāi)發(fā)利用。Te1：15177143553，E-mai1：15177143553@ qq.com

*通信作者：蔡 毅（1962—），男，教授，主要從事生藥鑒別研究。E-mai1：Caiyi118@163.com