熱休克蛋白70反義寡核苷酸對肝癌細胞增殖及凋亡的影響

賀海斌 劉青光 楊威

熱休克蛋白70反義寡核苷酸對肝癌細胞增殖及凋亡的影響

賀海斌 劉青光 楊威

目的 探討熱休克蛋白70反義寡核苷酸(HSP70 ASODN)對肝癌細胞增殖、凋亡的影響及其可能機制。方法 合成特異性靶向HSP70 ASODN，并將其轉染SMMC-7721細胞；四甲基噻唑藍(MTT)法檢測HSP70 ASODN對SMMC-7721細胞增殖的影響，計算生長抑制率；熒光顯微鏡觀察細胞凋亡形態；流式細胞儀分析細胞周期分布，計算細胞增殖指數；免疫細胞化學觀察細胞內HSP70、Bcl-2、Bax的表達。結果 ASODN組細胞生長抑制率明顯高于正義寡核苷酸（NSODN）組、轉染試劑對照組及空白對照組（P＜0.05）；形態學觀察到典型瘤細胞凋亡特征；流式細胞儀分析證實HSP70 ASODN主要阻止瘤細胞進入S期，細胞增殖指數下降，出現明顯的凋亡峰；免疫細胞化學顯示可降低細胞內HSP70、Bcl-2水平（P＜0.05），提升Bax水平（P＜0.05）。結論 HSP70 ASODN可抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖，誘導細胞的凋亡，可能機制為中和了HSP70和細胞周期調節蛋白間的相互作用，導致細胞周期阻滯，打破了腫瘤細胞逃逸凋亡平衡，促使細胞發生凋亡。

原發性肝細胞癌 熱休克蛋白70 反義寡核苷酸 凋亡

【 Abstract】 Objective To investigate the effect of heat shock protein 70 antisense oligonucleotide on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721. Methods Human HCC cell line SMMC-7721 was transfected in vitro with heat shock protein antisense oligonucleotide mediated by SofastTM.Cell growth inhibition was determined as percentage by the colorimetric MTT cell viability/proliferation assay.Cell morphological change of apoptosis was observed with fluorescence microscope.Distribution of cell cycle was analyzed by flow cytometry.Immunocytochemistry staining was used to observe the intra-cellular expression of HSP70、Bcl-2、Bax. Results The inhibiting proliferation rate of SMMC-7721 cells increased with the treatment dose and incubation time of HSP70 ASODN.These effects were not observed in the cells treated with normal sense oligonucleotide or SofastTM Transfection Reagent.Apoptotic bodies were observed in SMMC-7721 cells treated with HSP70 ASODN at a concentration of 400nmol/L for 48h.Cytometric analysis showed a significant decrease in the percentage of G2/M and S-phases while a significant increase in the percentage of G0/G1 among the total cells treated with HSP70 ASODN. The results showed that treatment of SMMC-7721 cells with HSP70 ASODN for 48h resulted in a inhibition of HSP70 and Bcl-2 expression,and an increased expression of Bax.While treatment with HSP70 normal sense oligonucleotide for 48h had no effect on expression of these proteins. Conclusion The abrogation of HSP70 by HSP70 ASODN exclusively can inhibit cell growth and induce cell apoptosis.

目前，原發性肝細胞癌的臨床治療效果仍不能令人滿意；基因治療是通過改變腫瘤細胞的分子基礎從而根本上抑制腫瘤的發生和發展，且對正常細胞的影響較小。筆者通過設計合成熱休克蛋白70反義寡核苷酸 （heat shock protein 70 antisense oligonucleotide， HSP70 ASODN）片段，體外轉染人肝癌細胞，觀察和分析其對細胞增殖和凋亡的影響，探討HSP70 ASODN治療原發性肝細胞癌的可行性，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 FCS（杭州四季青公司）；Tris堿（美國Promega公司）；鼠抗人HSP70抗體（工作液）、鼠抗人Bcl-2抗體（工作液）、鼠抗人Bax抗體（工作液）、SP-9002試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）；二甲亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍（MTT）、碘化丙啶（美國Sigma公司）；RPMI-1640培養液（美國GIBCO公司）；細胞凋亡-Hoechst 33258染色試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所）；梭華-SofastTM（廈門太陽馬生物工程有限公司）；HSP70 ASODN、正義寡核苷酸（NSODN）（上海生工生物工程有限公司）。超凈臺（蘇州凈化設備廠）；CO2孵育箱、低溫離心機、全自動純水裝置、酶標儀（德國Heraeus公司）；倒置顯微鏡、數碼相機（日本Olympus公司）；恒溫水浴箱、高壓鍋、液氮罐（北京市醫療設備廠）；78-1磁力加溫攪拌器（杭州儀表電機廠）；電子天平（德國Bosch公司）；流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）；微量移液器、高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；恒溫鼓風干燥爐（寧波自動化儀表廠）；熒光照相顯微鏡（LEICA DM LB2，德國Leica公司）；精密電子天平（瑞士Mettler公司）；濾膜（天津東康公司）；過濾器（德國Sartorius公司）；高速臺式離心機（上海安亭公司）；水平搖床（北京六一公司）；細胞培養瓶、細胞培養板（青島博維生物科技公司）。

1.2 HSP70 ASODN的設計與合成 針對HSP70 mRNA翻譯起始密碼子及下游5個密碼子設計HSP70 ASODN，HSP70 ASODN 5′-CGCCGCGGCTTTGGCCAT-3′、HSP70 NSODN 5′-ATGGCCAAAGCCGCGGCG-3′，均經全程硫代修飾，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 細胞培養 人肝癌細胞株（SMMC-7721）由第二軍醫大學病理解剖學教研室建株，西安交通大學醫學院第一附屬醫院檢驗醫學中心惠贈，為高轉移高侵襲細胞。采用含10%滅活小牛血清RPMI-1640培養液，于37℃、5%CO2培養箱中培養，0.25%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA（北京中杉生物技術有限公司）消化傳代。

1.4 四甲基噻唑藍（MTT）法測定細胞生長抑制率 取對數生長期細胞，用RPMI-1640培養液配成5×104個/ ml細胞懸液，接種于96孔板中，每孔175μl，加入藥物后終體積為200μl。隨機分成4組，每組復設6孔。量效實驗：（1）ASODN組：分別以100、200、400、600nmol/L A SODN轉染 SMMC-7721細胞；（2）NSODN組：以400nmol/L NSODN轉染SMMC-7721細胞；（3）轉染試劑組：加入等量梭華-SofastTM；（4）空白對照組：加等量RPMI-1640培養液。按梭華-SofastTM轉染試劑盒（廈門太陽馬生物工程有限公司）說明進行細胞轉染，在上述條件下繼續48h終止培養。時效實驗：選擇量效實驗最佳濃度作為實驗濃度，分別于轉染后24、48、72h終止培養。每孔加入0.5%MTT液20μl，繼續孵育4h，傾盡上清液，每孔加入DMSO150μl，搖床上搖動10min充分溶解甲瓚，酶標儀波長490 nm處檢測各孔光濃度值（OD值），計算細胞生長抑制率：生長抑制率=（對照組OD-實驗組OD）/對照組OD×100%。

1.5 Hoechst33258染色觀察細胞凋亡 2×105個/ml的單細胞懸液，接種在放置有預先處理過的蓋玻片的24孔板內，每孔438μl，培養24h后換液。隨機分為3組：400nmol/LHSP70 NSODN作用組、400nmol/LHSP70 ASODN作用組、正常對照組，每組6個復孔，加入RPMI-1640培養液，終體積均為500μl，繼續培養48h后終止。按試劑盒說明進行染色封片。置熒光顯微鏡下觀察并攝影，激發波長350nm，發射波長460nm。

1.6 流式細胞儀分析腫瘤細胞增殖周期分布 2×105個/ml的單細胞懸液，接種50ml培養瓶，每瓶4ml，培養24h后換液。隨機分為3組：400nmol/LHSP70 NSODN作用組、400nmol/L HSP70 ASODN作用組、正常對照組，繼續培養48h后終止。消化吹打成細胞懸液，離心1 500r/min×5min；細胞被重新懸浮于1ml冷鹽水中，慢慢加入-20℃95%的乙醇3ml，其最終濃度為70%，并輕輕吹打，冰浴30min，4℃固定，過夜；再離心，1 500r/ min×5min，PBS液洗2遍；細胞沉淀中加入0.1%RNA酶溶液150μl，重懸細胞，4℃30min；再加入0.1%碘化丙啶染色液120μl混勻，4℃避光孵育15min。進行流式細胞檢測。采用ModFit軟件分析，統計各時相細胞的百分比，記錄分布圖，計算細胞增殖指數（proliferation index，PI）：PI=（S+G2/M）/（G0/G1+S+G2/M）×100%。

1.7 免疫細胞化學 2×105個/ml的單細胞懸液，接種在放置有預先處理過的蓋玻片的24孔板內，每孔438μl，培養24h后換液。隨機分為3組：400nmol/ LHSP70 NSODN作用組、400nmol/LHSP70 ASODN作用組、對照組，每組6個復孔，加入RPMI-1640培養液，終體積均為500μl，繼續培養48h后終止。按試劑盒說明進行染色封片。用10%多聚甲醛室溫固定爬片細胞30min；吸出固定液，用PBS液手動輕輕晃動洗3遍；在爬片上滴加3%H2O2去離子水，室溫孵育5～10min；滴加正常山羊血清工作液，室溫孵育10～15min后，棄去血清；滴加一抗（HSP70、Bcl-2、Bax均為工作液），置4℃冰箱過夜；用PBS液手動輕輕晃動洗3遍；滴加生物素化羊抗小鼠IgG，-37℃孵育10～15min；用PBS液手動輕輕晃動洗3遍；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），室溫孵育10～15min；用PBS液手動輕輕晃動洗3遍；滴加二胺基聯苯胺（DAB液）顯色1～ 30min，肉眼和鏡下觀察顯色效果；自來水充分沖洗，終止顯色，常規梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。Nikeo光學顯微鏡觀察，Galaxy S攝像顯微鏡聯合Motic Images Advanced軟件采集圖像，并進行灰度值分析。

1.8 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 HSP70 ASODN對細胞生長的影響 MTT法觀察細胞生長抑制率發現，HSP70 ASODN轉染SMMC-7721細胞后各時間段，細胞的生長均受到顯著抑制，且這種作用呈劑量依賴性，即隨著ASODN劑量的增加，細胞的生長率隨之下降，詳見表1；在同一濃度400nmol/L下，隨著作用時間延長，細胞生長抑制率升高，詳見表2；而NSODN對細胞生長的抑制作用不明顯，單純的轉染試劑梭華-SofastTM對細胞的毒性很小。

表1 各濃度NSODN、ASODN作用48h對細胞增殖的影響

表2 400nmol/L ASODN作用24、48、72h對細胞增殖的影響

2.2 HSP70 ASODN對細胞凋亡的影響 DNA熒光染料Hoechst33258染色發現，HSP70 ASODN作用SMMC-7721細胞48h后，細胞發生凋亡。經DNA熒光染料Hoechst33258染色后，空白對照組的細胞膜完整，細胞質豐富而飽滿，呈現亮度、大小均勻一致的圓形或類圓形細胞核淺藍色熒光，而經過400nmol/L HSP70 ASODN處理48h后，可見核染色質凝集及邊緣化的細胞，部分細胞內可見凋亡小體，核膜消失或突起呈小泡樣，核質濃縮、碎裂。凋亡小體表現為邊緣模糊、皺縮、明顯較周圍正常細胞核小、高亮藍色的熒光團，詳見圖1。

圖1 Hoechst33258染色細胞凋亡圖（A：空白對照組；B：正義寡核苷酸組；C：反義寡核苷酸組；箭頭示凋亡小體；×400）

2.3 HSP70 ASODN對細胞周期分布的影響 流式細胞儀檢測發現，HSP70 ASODN處理后，G2/M期細胞比例顯著降低，S期細胞比例下降，G0/G1期細胞比例顯著上升，G0/G1期細胞PI由空白對照組的36.69%升至53.55%，S期細胞則由59.21%降至46.45%，G2/M期細胞幾近消失，說明細胞主要被阻斷在G0/G1期，細胞的增殖指數明顯下降；NSODN組細胞各期分布自然，PI維持在64.06%，詳見表3。

表3 3組各細胞周期PI的比較（%）

2.4 HSP70 ASODN對細胞內HSP70、Bcl-2、Bax表達的影響 免疫細胞化學顯示人肝癌SMMC-7721細胞內HSP70有較高表達，主要在細胞質；Bcl-2呈現細胞質棕褐色著色，核膜上星點狀輕微著色；Bax微弱表達，主要在細胞質。圖像灰度值分析顯示，經HSP70 ASODN處理48h后，圖像灰度值逐漸升高，與空白對照組及NSODN組比較差異均有統計學意義（均P＜0.01），細胞內HSP70顯著下降（P＜0.01）；Bcl-2在處理后表達顯著下降（P＜0.01）；Bax在處理后表達有顯著升高（P＜0.01）。NSODN組各檢測蛋白圖像的灰度值與空白對照組間無統計學差異，詳見表4。

表4 HSP70、Bcl-2、Bax的免疫細胞化學圖像分析灰度值表

3 討論

熱休克蛋白屬于分子伴侶超家族成員，是細胞生長、凋亡、蛋白質穩態的生物化學調節劑[1-2]。在腫瘤細胞中，多種熱休克蛋白高表達，并與腫瘤的發生、抗凋亡、免疫逃逸、惡性行為及不良預后密切相關[3-4]。近年來的研究表明，HSP70在肝細胞肝癌中高表達，是鑒別早期肝細胞肝癌與肝臟癌前病變、非腫瘤性肝病的良好生物學標志之一，細胞應激產生的HSP70有強大的抗凋亡作用，能夠保護、挽救細胞，防止細胞通過凋亡途徑死亡[5-7]。抗凋亡作用在腫瘤的發生、發展和耐藥方面起重要作用，因此誘導腫瘤細胞的凋亡和增強化療藥物的敏感性成為近年來腫瘤治療的重要策略。

本研究采用HSP70 ASODN阻斷人肝癌癌細胞SMMC-7721內HSP70的表達，以了解HSP70對人肝癌癌細胞的增殖和存活的影響，結果發現HSP70 ASODN不僅使SMMC-7721細胞的生長受到抑制并且誘導其發生凋亡，并且呈時間劑量依賴性。流式細胞儀檢測發現G2/M期細胞比例顯著降低，S期細胞比例下降，G0/G1期細胞比例顯著上升，有亞二倍體峰出現。免疫細胞化學顯示細胞內HSP70、Bcl-2水平顯著降低，Bax水平提升，而Bcl-2、Bax分別是Bcl-2家族中兩個重要的抑制和促進細胞凋亡的蛋白，其參與調節細胞增殖凋亡活動中可能與HSP70有關[8-10]。由此推測，HSP70 ASODN抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡的可能機制為中和了HSP70和細胞周期調節蛋白間的相互作用，導致細胞周期阻滯，打破了腫瘤細胞逃逸凋亡平衡，促使細胞發生凋亡。

本研究結果表明，HSP70對腫瘤的增殖和存活起著重要作用，通過反義寡核苷酸技術單獨地抑制肝癌細胞中HSP70的表達即可誘導細胞凋亡顯著增加，細胞生長受到顯著抑制。為今后HSP70 ASODN應用于肝癌的治療提供了新的理論依據，有望進一步提高肝癌的臨床治療效果。

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（本文編輯：嚴瑋雯）

《浙江醫學》對醫學論文中有關實驗動物描述的要求

在醫學論文的描述中，凡涉及實驗動物者，在描述中應符合以下要求：（1）品種、品系描述清楚，（2）強調來源，（3）遺傳背景，（4）微生物學質量，（5）明確等級，（6）明確飼養環境和實驗環境，（7）明確性別，（8）有無質量合格證，（9）有對飼養的描述（如飼料型、營養水平、照明方式、溫度、溫度要求），（10）所有動物數量準確，（11）詳細描述動物的健康狀況，（12）對動物實驗的處理方式有單獨清楚的交代，（13）全部有對照，部分可采用雙因素方差分析。

本刊編輯部

Effect of heat shock protein 70 antisense oligonucleotide on proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma cell

HE Haibin,LIU Qingguang,YANG Wei.
Department of General Surgery,Ningbo Medical Treatment center Lihuili Hospital,Ningbo 315040,China

Primary hepatocellular cancer Heat shock protein 70 Antisense oligonucleotide Apoptosis

2014-07-21）

315040 寧波市醫療中心李惠利醫院普通外科（賀海斌）；西安交通大學醫學院第一附屬醫院肝膽外科（劉青光、楊威）

劉青光，E-mail:liuqingguang@vip.sina.com.