HPV18 E7抗原T細胞表位的鑒定及CD4+T淋巴細胞的免疫反應(yīng)

余劍琴 徐云升 歐榮英 張乾 鄭飛云

HPV18 E7抗原T細胞表位的鑒定及CD4+T淋巴細胞的免疫反應(yīng)

余劍琴 徐云升 歐榮英 張乾 鄭飛云

目的 初步鑒定人乳頭瘤病毒（HPV）18型E7抗原的輔助T淋巴細胞（Th）表位及CD4+T淋巴細胞的免疫反應(yīng)。方法 以免疫磁珠進一步分離HLA-DRB1*0301陽性健康人外周血單核細胞（PBMC）中的CD4+T淋巴細胞，流式細胞儀鑒定細胞純度，用之前實驗中已獲得的3個HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位刺激外周血CD4+T淋巴細胞，用5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）檢測CD4+T淋巴細胞增殖活性。ELISA方法分析表位刺激CD4+T淋巴細胞分泌的細胞因子。結(jié)果 多肽P1（HPV18 E780-94）在體外刺激CD4+T淋巴細胞后能夠有效誘導(dǎo)CD4+T淋巴細胞增殖，P1組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），多肽P1（HPV18 E780-94）刺激CD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ，P1組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 P1（HPV18 E780-94）可能為HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位。

人乳頭瘤病毒 E7抗原 CD4+T淋巴細胞 Th表位

宮頸癌是女性最常見的的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居女性癌癥的第2位，死亡率居女性癌癥的第3位[1]。2012年國際癌癥研究機構(gòu)確定了導(dǎo)致宮頸癌的12種人乳頭瘤病毒（HPV）基因型，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58和HPV59，而HPV18是世界大部分地區(qū)宮頸癌患者中次于HPV16的第2位常見高危HPV，HPV18較HPV16具有更強的惡性轉(zhuǎn)化能力，與宮頸腺癌顯著相關(guān)，利用其制備的疫苗可能對腫瘤具有治療作用[2]。我們在前期研究中采用SYFPEITHI預(yù)測軟件，對靶抗原HPV18 E7的HLA-DRB1*0301限制性Th表位進行預(yù)測及預(yù)測肽合成、純化及質(zhì)譜鑒定，用合成的多肽在體外刺激人外周血單核細胞（PBMC），結(jié)果表明預(yù)測獲得的其中1個候選表位能刺激淋巴細胞增殖[3-4]。為了進一步驗證候選表位是否能刺激CD4+T淋巴細胞增殖，我們進一步進行了CD4+T淋巴細胞增殖試驗并檢測其極化方向，為進一步研制HPV18治療性表位疫苗提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 由Genbank獲得的HPV18 E7抗原由105個氨基酸組成，其序列見文獻[4]。將HPV18E7抗原氨基酸序列輸入SYFPEITHI網(wǎng)站工作，篩選并合成出3條HLA-DRB1*0301限制性多肽，P1（80-94）ADDLRAFQQLFLNTL，P2（72-86）IELVVESSADDLRAF，P3（18-32）QNEIPVDLLCHEQLS，分離HLA-DRB1*0301陽性健康人PBMC，為本實驗準備，詳見文獻[4]。

1.2 試劑 Dynal CD4+T淋巴細胞陰性分選試劑盒及Dynal MPC-15磁性分離架購自挪威Dynal公司，5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）購自德國Roche公司，流式細胞儀由美國Becton Dickinson公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 Dynal免疫磁珠分離CD4+T淋巴細胞及純度鑒定使用Dynal CD4+T淋巴細胞陰性分選試劑盒分離PBMC，分離后所得CD4+T淋巴細胞用流式細胞儀計數(shù)并鑒定純度，分析軟件為Cell Quest V3.2。同時檢測分離前后CD4+T淋巴細胞活力。

1.3.2 CD4+T淋巴細胞增殖實驗 為了進一步驗證P1、P2、P3三個多肽是否能刺激CD4+T淋巴細胞增殖，本實驗進一步進行了CD4+T淋巴細胞增殖試驗。（1）輔助細胞的處理：將分離得到的PBMC接種于25ml培養(yǎng)瓶中，37℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后經(jīng)直線加速器照射（30Gy）去增殖，作為抗原遞呈細胞（APC）。（2）CD4+T淋巴細胞培養(yǎng)：調(diào)整CD4+T淋巴細胞濃度為2×106/ml，PBMC濃度為4×106/ml，于96孔平底培養(yǎng)板，每孔加入CD4+T淋巴細胞2×105、照射過的PBMC 2× 105，同時分別加入稀釋好的合成多肽P1、P2、P3各10μg/ml（下文簡稱P1組、P2組、P3組）；陰性對照孔只加稀釋液，不含合成多肽（NC組）；陽性對照孔加入植物血凝素（PHA），終濃度10μg/ml；空白孔為不含細胞的IMDM培養(yǎng)液；同時設(shè)立CD4+T淋巴細胞加合成多肽（P1、P2、P3）及APC加PHA的對照孔，終體積為200μl。每組做3個平行孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)結(jié)束前24 h加入BrdU20μl。用酶標儀測定吸光度（OD）值，OD值＝實驗組OD值－空白對照組OD值。

1.3.3 ELISA法檢測細胞因子 為了分析篩選出的表位肽誘導(dǎo)CD4+T淋巴細胞分泌的細胞因子，采用ELISA法檢測多肽與CD4+T淋巴細胞共培養(yǎng)上清液中的細胞因子。將CD4+T細胞懸液調(diào)成細胞濃度為1×106/ml，經(jīng)照射的PBMC懸液調(diào)成細胞濃度為1×106/ml；各取100μl鋪于24孔培養(yǎng)板，加入合成多肽（10μg/ml），總體積0.5ml/孔；陰性對照孔只加稀釋液，不含合成多肽。每組做3個平行孔，37℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束后離心，1 500r/min，5min，收集細胞懸液400μl置入Eppendorf管，上清液用ELISA法測定細胞因子IFN-γ、IL-10和IL-4表達情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 CD4+T淋巴細胞純度 用PE標記的抗人CD3和FITC標記的抗人CD4加入PBMC分離前后試管，經(jīng)流式細胞分析，可見分離前CD4+T淋巴細胞純度為45.25%，分離后的純度達到90.71%以上，可以進行后續(xù)實驗（圖1）。

2.2 細胞懸液中CD4+T淋巴細胞的活力 臺盼藍拒染法計數(shù)細胞總數(shù)及死細胞數(shù)，計算細胞活力，免疫磁珠分離前后CD4+T淋巴細胞的活力分別為（96.15±2.36）%及（94.32±3.11）%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 CD4+T淋巴細胞增殖情況 分離的CD4+T淋巴細胞與照射后的PBMC及合成多肽共同培養(yǎng)，結(jié)果顯示P1能刺激CD4+T淋巴細胞增殖，NC組與P1組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。PBMC在此作為APC輔助多肽刺激CD4+T淋巴細胞增殖，經(jīng)直線加速器照射可以抑制其增殖，用PHA刺激照射的PBMC（即APC）不能使其增殖。APC＋PHA組及未經(jīng)照射PBMC+PHA組OD值分別為0.228±0.010、0.930±0.045，兩組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明體系中增殖的細胞為CD4+T淋巴細胞；在CD4+T淋巴細胞增殖實驗時同時還設(shè)立了CD4+T淋巴細胞加抗原的對照，發(fā)現(xiàn)在缺乏APC的情況下CD4+T淋巴細胞也不能增殖；P1（CD4+＋PBMC＋多肽）組與CD4+＋P1多肽組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明多肽刺激CD4+T淋巴細胞增殖需要APC的輔助，而不是非特異性的刺激反應(yīng)。詳見圖2。

2.4 ELISA法檢測多肽刺激淋巴細胞增殖后的細胞因子表達情況 P1能刺激CD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ，P1組與NC組及P2組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），P1組與P3組比較差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而P1、P2、P3組與NC組比較，IL-10、IL-4水平的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），詳見圖3。此結(jié)果表明P1能刺激Th0細胞向Th1細胞分化。

圖1 流式細胞術(shù)鑒定免疫磁珠分離前后CD4+T淋巴細胞的純度（A：分離前；B：分離后）

圖2 不同多肽刺激CD4+T淋巴細胞增殖結(jié)果的比較

3 討論

高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的始動因子，宮頸癌的發(fā)生要經(jīng)過一個較長的癌前病變階段，在這個階段可通過免疫學(xué)手段來幫助清除體內(nèi)病毒，這就需要尋找HPV治療性疫苗。其中合成多肽疫苗安全，容易儲存和處理，有理想的靶特異性，是一類很有潛力的疫苗。目前對HPV16治療性多肽疫苗研究較多，而37%～41%的宮頸腺癌是由感染HPVl8引起[5]，因此，目前HPV18疫苗的研制和開發(fā)正日益受到關(guān)注。Th表位是外源蛋白經(jīng)APC處理后與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合并提呈到細胞表面供CD4+T淋巴細胞識別的短肽，其引發(fā)的CD4+T淋巴細胞應(yīng)答對于輔助B細胞及CTL發(fā)揮效應(yīng)具有重要作用。本研究結(jié)果也顯示，多肽刺激CD4+T淋巴細胞增殖需要APC的輔助，而不是非特異性的刺激反應(yīng)。

圖3 不同多肽刺激CD4+T淋巴細胞增殖后細胞因子表達結(jié)果的比較

Zhao等[6]以重組痘苗病毒rVVJ18 E7、E6多肽分別免疫C57BL/6和BALB/c小鼠，檢測其所誘發(fā)的細胞免疫反應(yīng)，結(jié)果表明重組痘苗病毒rVVJ18 E7、E6免疫的兩種品系小鼠均可測到E6肽庫刺激產(chǎn)生的特異性細胞免疫反應(yīng)，篩選確定2種多肽為CD8的T細胞表位。本研究結(jié)果顯示，通過體外HPV18E7抗原多肽刺激CD4+T淋巴細胞，可檢測到細胞增殖及細胞因子分泌，根據(jù)此文獻可進一步做動物實驗驗證。

以往有關(guān)HPV治療性多肽疫苗的研究主要是針對HLA-A2限制性CTL表位開展的。Ramos等[7]在體外試驗中，給予由11個氨基酸組成的HPV16 E6/E7抗原肽（來自多肽庫）刺激68例HPV相關(guān)腫瘤患者的PBMC及PBMC衍生的樹突狀細胞，發(fā)現(xiàn)HPV16 E6/E7能誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生特異性的CTL增殖，并能夠分泌IFN-γ及IL-6等細胞因子，以上結(jié)果表明，HPV16 E6/E7多肽抗原在體外能誘導(dǎo)淋巴細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，與本研究的結(jié)果一致。

近年的研究策略已開始關(guān)注CD4+T淋巴細胞對HPV感染的影響。Zwaveling等[8]的研究表明，CpGDNA同HPV16 E743-77（含有H-2Kb限制性CTL表位HPV16 E749-57及Th表位E748-54）35肽合用，可使10只宮頸癌移植瘤小鼠中的8只腫瘤完全消退，另2只小鼠的腫瘤生長也較對照組緩慢，而CpGDNA同HPV16 E749-57肽合用僅能使9只宮頸癌移植瘤的小鼠中的3只腫瘤完全消退。Kim等[9]將巴氏涂片異常而行陰道鏡組織活檢的患者分為兩組，一組是活檢為CIN1,2,3為persistors組（n=51），另一組是活檢正常為regressors組（n=33），檢測INF-r、Tregs，結(jié)果表明regressors組CD4+T淋巴細胞反應(yīng)比persistors組高，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.015）。以上研究結(jié)果說明CD4+T淋巴細胞免疫反應(yīng)在腫瘤免疫中起關(guān)鍵性作用。本研究結(jié)果顯示，多肽P1（HPV18 E780-94）在體外刺激CD4+T淋巴細胞后能夠有效誘導(dǎo)CD4+T淋巴細胞增殖，為今后以表位為基礎(chǔ)的HPV疫苗設(shè)計提供了實驗依據(jù)。

本研究選用BrdU比色法。BrdU與胸腺嘧啶具有結(jié)構(gòu)的相似性，能代替胸腺嘧啶摻入S期細胞新合成的DNA鏈內(nèi)。近年來進一步證實，3H-TdR和BrdU所標記的S期細胞結(jié)果完全一致，但BrdU更具有省時、簡便、重復(fù)性好和無放射性等優(yōu)點，BrdU具有更高的敏感性和可重復(fù)性。本研究采用淋巴細胞功能試驗驗證的方法鑒定出HPV18 E7抗原Th表位。在預(yù)測獲得的3條多肽中，經(jīng)淋巴細胞增殖試驗證實P1能刺激淋巴細胞增殖。結(jié)果表明，經(jīng)P1刺激后CD4+T淋巴細胞的比例較培養(yǎng)前以及未加多肽刺激的對照組均有明顯增加，未加多肽刺激的對照組相對培養(yǎng)前無明顯增加。同時經(jīng)細胞因子檢測，可以得出HPV18 E780-94能誘導(dǎo)活化CCD4+T淋巴細胞分泌IFN-γ。

綜上所述，本研究初步證實E780-94是HPV18E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th1表位，為今后評價E7蛋白的細胞免疫效果提供了實驗依據(jù)。

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Identification of specific T lymphocyte epitope on E7 antigen of human papillomavirus type 18 and CD4+T-cell response

YU Jianqin, XU Yunsheng,OU Rongying，et al.
Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000,China

Objective To identify specific T lymphocyte epitope on E7 antigen of human papillomavirus type 18 and CD4+T-cell responses. Methods Three epitope candidates of human papillomavirus 18 E7 antigen(P1,P2 and P3)were obtained previously.Peripheral blood mononuclear cell(PB MC)from HLA-DRB1*0301-positive healthy donors were prepared and CD4+T cells were separated by Dynal Immunomagnetic beads isolation.The purity was determined by flow cytometry.The predicted peptides were scored as immunogenic ability to stimulate CD4+T cells.Proliferative activity was analyzed with Brdu cell proliferation assay.The cytokine production of CD4+T cells induced by the peptides was detected by ELISA. Results Peptide P1 (HPV18 E780-94)stimulated proliferation of CD4+T cells and the OD value was significantly higher than that of negative control group(P＜0.01).Peptide P1(HPV18 E780-94)also stimulated CD4+T cells to secrete IFN-γ and IFN-γ value was significantly higher than that of negative control group(P＜0.01). Conclusion Peptide P1(HPV18 E780-94)can be the HLA-DRB1*0301-restricted Th epitope of human papillomavirus 18 E7 antigen,which provides the basis to evaluate cellular immune response elicited by HPV18 E7 protein based vaccine.

Human papillomavirus E7 antigen CD4+T cells T lymphocyte epitopes

2015-01-21）

（本文編輯：沈叔洪）

國家自然科學(xué)基金項目（30500537）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科（余劍琴、歐榮英、張乾、鄭飛云），皮膚科（徐云升）

鄭飛云，E-mail：ZFY@hosp1.ac.cn