骨髓組織印片在急性白血病化療后形態學評估中的價值

莫偉明 劉軍 葉君 楊愛平 陳琴琴 楚旭 蘇萍 周其良

骨髓組織印片在急性白血病化療后形態學評估中的價值

莫偉明 劉軍 葉君 楊愛平 陳琴琴 楚旭 蘇萍 周其良

目的 探討骨髓組織印片在急性白血病化療后形態學評估中的實用價值。方法 收集126例次急性白血病患者化療后同步進行骨髓涂片、組織印片和切片檢查結果，比較骨髓涂片、組織印片和切片在有核細胞量、緩解度、診斷符合率性能指標中的差異。結果 組織印片與骨髓涂片在有核細胞量分級分布差異有統計學意義（P=0.000），而組織印片與切片無統計學差異（P=0.997）。組織印片與骨髓涂片在顯示緩解度分布有統計學差異（P=0.003），而組織印片與切片無統計學差異（P=0.955）。以切片顯示緩解度為標準：切片完全緩解（CR）組中，組織印片與涂片符合率無統計學差異（98.6%、100%，P=1.000）；切片部分緩解（PR）組中，組織印片與骨髓涂片符合率有統計學差異（88.4%、46.5%，P=0.000）；切片未緩解（NR）組中，組織印片與骨髓涂片符合率有統計學差異（84.6%、38.5%，P=0.041）；組織印片在靈敏度、特異度、陽性預測值、陽性似然比、Youden指數等性能指標總體上優于骨髓涂片。結論 骨髓組織印片兼有涂片和切片的特征，組織印片聯合骨髓涂片互補性檢查，對急性白血病化療后骨髓造血評估具有明顯優勢。

骨髓組織印片 急性白血病 診斷 價值

骨髓檢查是評估各種疾病包括腫瘤和非腫瘤性血液疾病的重要診斷方法，骨髓穿刺涂片（bone marrow aspiration，BMA）、骨髓組織印片（bone marrow imprint, BMI）和骨髓活檢切片（bone marrow biopsy，BMB）是其3個基本的細胞學檢查項目[1]。目前，急性白血病（acute leukemia，AL）骨髓檢查完全緩解（complete remission，CR）標準仍以光鏡下BMA中原始細胞≤5%作為主要指標[2]，但由于白血病細胞間吸附力、細胞與間質黏著力、細胞塞實程度等因素影響，抽吸髓液時容易被稀釋，導致BMA難以真實的反映骨髓造血及腫瘤細胞增生情況。近年來，國內外對于BMA與BMB比較診斷報道較多[3-4]，但兼有BMA和BMB特征的BMI尚未引起人們的足夠重視，較少有報道BMI對于AL化療后骨髓細胞緩解度評估中的價值。因此，筆者回顧了126例次AL患者化療后同步進行的BMA、BMI及BMB檢查結果，并評估其檢查方法在顯示有核細胞量、緩解度、診斷符合率中的差異，探討BMI在AL患者化療后骨髓細胞形態學評估中具有獨特的診斷價值，現將結果報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2006年6月至2014年7月在我院確診AL患者73例，其中男38例，女35例，年齡23～82（46.2±13.3）歲。AL診斷標準均參照張之南主編《血液學診斷及療效標準》[5]診斷標準，其中急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）11例，急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）62例（FAB分型：M01例，M12例，M223例，M312例，M416例，M56例，M62例），在血液科化療后進行126例次同步BMA、BMI及BMB檢查。

1.2 方法

1.2.1 BMA、BMI及BMB制備及染色 患者髂后上棘抽吸髓液制成BMA后，采用國產B65-01型骨髓活檢針以環鉆二步法獲取骨髓組織（長度在0.5cm以上），將針內骨髓組織置于載玻片上，用2張玻片面對面輕輕均勻滾動組織制成BMI（骨髓組織放入Bouin固定液），BMI與BMA同步進行Wright－Giemsa染色；骨髓組織經濃度逐級遞增的乙醇進行組織脫水、漂洗、吸干、包裹、切片、貼片與烤片制成BMB，行常規組織化學染色，蘇木素-姬姆薩-酸性品紅（haematoxylin-giemsa-fuchsin，HGF）、網狀纖維染色和免疫組化CD34。

1.2.2 評估BMA、BMI及BMB顯示有核細胞量差異 BMA與BMI有核細胞量評定方法采用顯微鏡（日本Olympus公司，BX40）油鏡下觀察10個視野計算平均有核細胞數，將有核細胞量劃分為極度減少、明顯減少、輕度減少、正常、輕度增多、明顯增多、極度增多7個等級，上述7個等級有核細胞量均值分別對應為＜5個、5～14個、15～24個、25～50個、51～70個、71～90個、＞90個[6-7]；BMB有核細胞量評估參照浦權主編《血液病骨髓診斷病理學》[8]，以計點法檢測造血組織所占容積評估有核細胞量（骨髓增生程度），對于上述7級別的有核細胞百分比分別為＜10%、11%～25%、26%～40%、41%～64%、65%～77%、78%～90%、＞90%。比較BMA、BMI及BMB顯示有核細胞量差異。

1.2.3 評估BMA、BMI及BMB顯示緩解度差異 觀察BMA和BMI顯示緩解度是在光鏡下（×1 000）分類計數200個有核細胞，計算原始細胞百分比含量（%）；觀察BMB顯示緩解度是在光鏡（×400）下觀察其原始細胞并依據免疫組化CD34陽性率，估算原始細胞所占有核細胞比例（通常為約數）。將AL患者化療后緩解程度依據原始細胞量劃分3組[2，9]：CR：原粒細胞≤5%；部分緩解（partial remission，PR）：5%＜原粒細胞≤20%；未緩解（non-remission，NR）：原粒細胞＞20%。原始細胞定義范圍包括[9]：原始粒細胞、原始單核細胞+幼稚單核細胞、原始巨核細胞、異常早幼粒細胞（M3）、原始淋巴細胞+幼稚淋巴細胞（ALL）。評價BMA、BMI及BMB之間顯示緩解度差異。

1.2.4 BMA和BMI診斷指標性能評價 以BMB顯示緩解度為金標準，靈敏度（%）=真陽性數/（真陽性數+假陰性數）×100%；特異度（%）=真陰性數/（真陰性數+假陽性數）×100%；陽性似然比=靈敏度/（1-特異度）；陽性預測值=真陽性/（真陽性+假陽性）；Youden指數=靈敏度+特異度-1。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計數資料比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 126例次AL患者化療后BMA、BMI及BMB顯示有核細胞量（增生程度）分布比較 見表1。

表1126 例次AL患者化療后BMA、BMI及BMB顯示有核細胞量分布比較[例次（%）]

由表1可見，BMI與BMA在有核細胞量分級分布中有統計學差異（χ2=29.452，P=0.000），而BMI與BMB間比較差異無統計學意義（χ2=0.589，P=0.997）。BMI與BMB有核細胞量分級分布中相同率達96.0%（121/ 126），而BMI與BMA僅有70.6%（89/126）相同。

2.2 126例次AL患者化療后BMA、BMI及BMB顯示緩解度分布的比較 見表2。

表2 126例次AL患者化療后BMA、BMI及BMB顯示緩解度分布比較[例次（%）]

由表2可見，BMI與BMB顯示緩解度分布的差異無統計學意義（χ2=0.092，P=0.955），BMI顯示緩解度評估性能接近于BMB；而BMI與BMA顯示緩解度分布差異有統計學意義（χ2=11.389，P=0.003）。96例BMA顯示CR中BMI、BMB共同顯示CR僅為55.6%（70/126），部分在BMA中顯示CR，卻在BMI和BMB中顯示為PR或NR。

2.3 BMA和BMI顯示緩解度符合率及各項性能指標的評價 見表3。

表3 BMA和BMI顯示緩解度符合率及各項性能指標的評價

由表3可見，在BMB顯示CR組中，BMI符合率為98.6%（69/70）與BMA 100%（70/70）差異無統計學意義（χ2=0.000，P=1.000）；BMB顯示PR組中，BMI符合率88.4%(38/43)明顯高于BMA 46.5%（20/43），差異有統計學意義（χ2=17.158，P=0.000）；BMB顯示NR組中，BMI符合率84.6%（11/13），明顯高于BMA 38.5%（5/ 13），差異有統計學意義（χ2=5.850，P=0.041）。在BMB顯示CR組中，除靈敏度外，特異度、陽性預測值、陽性似然比、Youden指數均優于BMA；在BMB顯示PR組中，靈敏度、特異度、陽性預測值、陽性似然比、Youden指數全部指標均優于BMA；在BMB顯示NR組中，靈敏度、Youden指數優于BMA。

3 討論

隨著血液學的發展，免疫學、細胞遺傳學、分子生物學技術在血液系統疾病中的應用，AL的CR含義不斷深入，出現了細胞遺傳學CR、分子生物學CR，以及應用流式細胞技術檢測CR后的微小殘留病變（minimal residual disease，MRD），但國內外專家均認為基礎的細胞形態學仍然是評價腫瘤和非腫瘤性血液病的一種不可或缺的檢查方式，它對于AL后續的化療監測非常重要[2，10-11]。BMA檢查方法簡便、快速，在觀察細胞形態、細胞數量、細胞比例上變化見長，但其不足之處也為人們所共識，譬如抽吸液稀釋、骨髓基質對細胞的黏附力、推片力度等原因，涂片難以真實的反映骨髓造血情況。BMB可以彌補BMA的不足，臨床實踐已經發現BMA顯示CR時部分患者同期的BMB仍可發現散在的原始細胞灶或幼稚前體細胞異常定位（abnormal localization of immature precursors，ALIP），是非真正意義上的CR[12-14]，但其檢查操作復雜、出報告周期長（至少48～72h）[10，15-16]。現階段，國內BMA細胞形態學與BMB組織病理學檢查大多屬于不同科室進行檢查，造成兩種方法不能有效地結合，影響了兩者相互疊加的診斷價值。BMI卻兼有BMA和BMB的特征，可與BMA同步互補鏡檢，可以正確快速評估AL化療后真實的骨髓造血及緩解程度。

筆者通過對AL化療后同步進行的BMA、BMI及BMB檢查結果分析發現，BMI最實用和最有意義的價值是對骨髓有核細胞量的評估，細胞量的增多會使診斷變得更加明確和容易。本研究結果顯示，BMI在有核細胞量分級評估性能與BMB接近（P＞0.05），而BMI評估性能優于BMA（P＜0.05）。由此可見，BMA由于穿刺稀釋或受白血病細胞塞實的影響，未能客觀反映骨髓有核細胞增生的實際情況，而BMI能較客觀地顯示了骨髓增生的真實程度，可以矯正BMA在顯示有核細胞量方面的欠正確性。BMI是將骨髓組織直接在玻片上印制，干擾因素明顯比骨髓穿刺和骨髓液制成的BMA少，故一般情況下，BMI的有核細胞量要高于BMA[17]。BMI可避免再次骨髓穿刺的困惑，可迅速及時地對BMA欠缺的標本提供有價值的診斷信息。AL患者BMI顯示有核細胞量增生活躍或明顯活躍時，可適當延長化療時間，將有利于提高緩解的質量，延長緩解期和患者生存期[14]。

目前，國際上通用的判斷骨髓細胞形態學CR的標準為：在骨髓抽吸涂片細胞數足夠的情況下（＞20%），骨髓中原始細胞比例≤5%，無Auer小體；同時外周血中無可檢測到的原始細胞，且中性粒細胞≥1.5×109/L，血小板≥100×109/L[18]。筆者通過對AL患者化療后BMA、BMI及BMB顯示緩解度比較發現，BMI與BMB顯示緩解度分布大致相同或比較接近（P＞0.05），而BMI明顯優于BMA（P＜0.05）；筆者以BMB顯示緩解度為金標準，發現BMI診斷符合率（靈敏度）、特異度、陽性預測值、陽性似然比、Youden指數等指標優于BMA。由此可見，BMI比BMA更能真實的反映AL化療后骨髓原始細胞殘留情況，更準確的評估細胞學緩解程度。萬楚成等[13]報道46例AL患者BMA已經顯示CR，與此同時BMI顯示CR僅65.2%（30/46），PR多達23.9%（11/46），NR也有10.9%（5/46）。顧鳳蘭等[14]報道43例次BMA顯示CR,BMI顯示CR僅25例，而PR 13例、NR 5例。筆者認為BMI有核細胞雖未受人為推片推開，胞體相互擠壓變形，影響了部分細胞密集區域形態學觀察，但在有核細胞分布相對寬松的區域基本可以識別出原始細胞。BMB中出現ALIP結構或原始細胞小灶性增生時，BMA顯示原始細胞比例常低于同期進行的BMB，因為網硬蛋白纖維可阻留部分原始細胞，ALIP和原始細胞小灶結構在抽吸和涂片過程中已經解體并分散于整個涂片，加之骨髓纖維化導致骨髓抽吸稀釋。與此同時，BMI常出現原始或早期細胞集積性增生，可以彌補單純BMA檢查的不足,能比BMA更接近真實地反映造血組織中的病變。因此，BMA顯示CR，還不能認為真正達到CR，BMA不能客觀的反映骨髓腫瘤細胞真實的增生情況，會造成部分患者骨髓細胞學緩解的假象。如單純依靠BMA結果，部分患者得不到進一步的誘導治療或雖然經誘導治療仍未達到CR者，絕大多數患者在短期內復發[13-14]。BMI是連接BMA與BMB檢查的紐帶，BMI能更客觀的反映骨髓原始細胞殘留量,與BMA互補檢查能更快速、準確的指導臨床治療，進一步提高AL的療效。

綜上所述，在基層血液病實驗室細胞遺傳學、分子生物學等檢測手段尚難以開展的情況下，BMI可以彌補部分BMA和BMB的不足，BMI與BMA快速同步在檢驗科進行細胞形態學互補檢查，能更好的指導臨床早期、快速、正確的評估AL化療后骨髓有核細胞量、原始細胞殘留量、緩解度,值得推廣。

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Application of bone marrow imprints in diagnosis of acute leukemia after chemotherapy

MO Weiming,LIU Jun,YE Jun,et al.
Department of Clinical Laboratory,Zhejiang Xiaoshan Hospital,Hangzhou 311202,China

【 Abstract】 Objective To evaluate the application of bone marrow imprints in diagnosis of acute leukemia after chemotherapy. Methods Bone marrow aspiration,bone marrow imprints and bone marrow biopsy of 126 patients with acute leukemia after chemotherapy were collected.The amount of nucleated cells,the degree of remission,diagnostic accordance rate was compared among three methods. Results The grading distribution of nucleated cells in bone marrow imprints was significantly different to bone marrow aspiration (χ2=29.452,P=0.000),but close to that of bone marrow biopsy(χ2=0.589,P=0.997).The degree of bone marrow remission shown on bone marrow imprints was significantly different to that on bone marrow aspiration (χ2=11.389,P=0.003),and close to that on bone marrow biopsy(χ2=0.092, P=0.955).With the results of bone marrow biopsy as gold standard,the diagnostic accordance rates in complete remission(CR)for bone marrow aspiration and bone marrow imprints were 98.6%and 100.0%,respectively(Fisher's exact probability P=1.000);the accordance rates in partial remission(PR)for bone marrow aspiration and bone marrow imprints were significantly different(88.4%,46.5%,χ2=17.158,P=0.000);the accordance rates in non-remission(NR)for bone marrow aspiration and bone marrow imprints were significantly different(84.6%,38.5%,χ2=5.850,P=0.041).The overall sensitivity,specificity,positive predictive value,positive likelihood ratio,Youden index of bone marrow imprints were better than those of bone marrow aspiration. Conclusion Bone marrow imprints with characteristics of both bone marrow aspiration and bone marrow biopsy,have advantages for assessment of bone marrow hematopoietic in acute leukemia after chemotherapy.

Bone marrow imprints Acute leukemia Diagnosis Value

2014-12-09）

（本文編輯：嚴瑋雯）

311202 杭州，浙江蕭山醫院檢驗科（莫偉明、劉軍、葉君、楊愛平、陳琴琴、楚旭），血液科（蘇萍、周其良）

莫偉明，E-mail：moweiming@zjxsh.com