強直性脊柱炎患者英夫利昔單抗治療后MMP-3、MMP-9的變化及臨床意義

劉偉麗 張瑾 李聲東 丁健 應振華

●臨床研究

強直性脊柱炎患者英夫利昔單抗治療后MMP-3、MMP-9的變化及臨床意義

劉偉麗 張瑾 李聲東 丁健 應振華

目的 探討強直性背脊柱炎（AS）患者英夫利昔單抗治療后血清基質金屬蛋白酶（MMP）3、9的變化，以及其與患者臨床疾病活動性的相關性。方法 對44例AS患者分別于第0、2、6、12周給予靜脈微泵滴注英夫利昔單抗針200mg或300mg，其中合并外周關節炎者25例；采用ELISA法檢測英夫利昔單抗治療前、治療第12周血清MMP-3、MMP-9水平，同時采用血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）、強直性脊柱炎疾病活動指標（ASDAS）、Bath AS功能指數（BASFI）、Bath AS活動度衡量指數（BASMI）對患者進行臨床疾病活動性評估。結果 44例AS患者治療12周后，血清MMP-3、MMP-9水平以及ASDAS、BASFI、BASMI、ESR、CRP均有下降，差異均有統計學意義（均P＜0.01），34例患者（77.3%）達臨床重要改善，其中5例患者（11.4%）達臨床顯著改善。治療前，血清MMP-3水平與ESR、CRP及ASDAS、BASFI有相關性（P＜0.01），血清MMP-9水平與CRP及ASDAS、BASFI、BASMI有相關性（P＜0.05）。治療前后，血清MMP-3下降水平與ASDAS、BASFI、ESR、CRP的改善有相關性（P＜0.05），而與BASMI的改善無關（P＞0.05），血清MMP-9下降水平與BASMI、CRP的改善相關（P＜0.05）。合并外周關節炎組的血清MMP-3、ESR、CRP水平均顯著高于不合并外周關節炎組（P＜0.05），而血清MMP-9水平低于不合并外周關節炎組（P＜0.05）。結論 血清MMP-3、MMP-9水平與AS患者的疾病活動指標高度相關，可以作為英夫利昔單抗治療時的病情監測指標，其中MMP-3在合并外周關節炎時升高顯著，MMP-9水平變化在不合并外周關節炎時升高。

強直性脊柱炎 疾病活動性 基質金屬蛋白酶3 基質金屬蛋白酶9

強直性脊柱炎（AS）是以中軸關節慢性炎癥為主、原因不明的全身免疫性疾病，臨床表現常伴有外周關節炎、附著點炎，影響患者日常生活和工作。該病為慢性疾病，但容易急性反復發作。近年來，TNF-α拮抗劑的臨床應用使AS治療有效率顯著提高。但因這類藥物價格昂貴，目前多用于急性活動期的治療。臨床上一些常用的急性期炎癥指標，如血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP），與AS的活動性有一定相關性，但并不能完全反映病情[1]，在臨床中的應用有一定局限性。因此，尋找能夠反映這類疾病炎癥、預測治療療效的生物學標志物，指導臨床醫師確定及時、有效的治療方案具有重要意義。近年來研究發現，細胞因子、基質金屬蛋白酶（MMPs）和AS疾病活動性相關[2-3]。MMPs是體內主要的蛋白水解酶家族之一，不僅參與AS炎癥，還是調節骨質破壞病理過程的重要因素；其中MMP-3和MMP-9是起主要作用的MMPs，它們在AS疾病急性活動期呈高表達，同時作為關節破壞的間接標志物，是關節受到更多侵蝕的預測指標。筆者通過檢測血清MMP-3和MMP-9在AS急性活動期患者中的表達水平，以及它們在應用英夫利昔單抗治療后的變化，探討其與疾病活動度的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2012年8月至2014年2月在寧波市李惠利醫院（30例）及浙江省人民醫院住院（14例）并確診AS的44例患者資料，其中男39例，女5例，年齡18～56（28±8）歲；病程1～20（4.6±3.2）年；合并外周關節炎者25例。所有患者均符合1984年修訂AS紐約標準[4]，并處于疾病活動期（ASDAS≥1.3分），且排除感染、腫瘤性疾病的患者。所有患者均未合并使用糖皮質激素和雙磷酸鹽類藥物，合并消炎鎮痛藥物要求穩定劑量4周以上。本研究經倫理委員會批準。

1.2 方法 所有患者分別于第0、2、6、12周給予靜脈微泵滴注英夫利昔單抗針（商品名：類克，Cilag AG公司生產，100mg/瓶），劑量參照3～5mg/kg給予患者應用英夫利昔單抗針200mg或300mg。

1.3 血清MMP-3、MMP-9水平測定 在第0、12周注射英夫利昔單抗時采集血清，保存于-80℃備用。實驗時分別以1∶10、1∶1稀釋，采用ELISA法，應用美國R&D公司提供的人血清MMP-3、MMP-9抗體-ELISA試劑盒（產品編號：750598.4、750319.9），按試劑盒說明書進行操作。

1.4 療效評價 療效評價參數包括：（1）臨床表現和體征的評估：強直性脊柱炎疾病活動指標（ASDAS）[5]、Bath AS功能指數（BASFI）[6]、Bath AS活動度衡量指數（BASMI）[7]，中度活動為1.3≤ASDAS＜2.1，重度活動為2.1≤ASDAS＜3.5，嚴重活動為ASDAS≥3.5；（2）實驗室指標：ESR、CRP代表炎性指標，血常規、肝腎功能常規監測不良反應。分別在第0、12周對上述療效指標進行評估和監測。ASDAS改善＞1.1為臨床重要改善，ASDAS改善＞2.0為臨床顯著改善[5]。

1.5 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，血清MMP-3、MMP-9水平與臨床活動性指標相關性分析采用Spearman相關。

2 結果

2.1 AS患者治療前后血清MMP-3、MMP-9水平及臨床活動性指標的變化 44例患者應用英夫利昔單抗治療12周后，血清MMP-3、MMP-9水平與治療前比較差異均有統計學意義（均P＜0.01）；治療后ASDAS、BASFI、BASMI、ESR、CRP較治療前均有下降，差異均有統計學意義（P＜0.01），詳見表1。

表1 AS患者治療前后血清MMP-3、MMP-9水平及臨床活動性指標的變化

2.2 AS患者臨床疾病活動性指標評估 44例患者治療前平均ASDAS為2.56±0.69，其中中度活動8例，重度活動20例，嚴重活動3例。所有患者均接受英夫利昔單抗針治療12周時，平均ASDAS為0.94±0.55，其中27例患者達臨床緩解期（ASDAS＜1.3），中度活動15例，重度活動2例，嚴重活動0例；34例患者ASDAS改善＞1.1，其中5例患者ASDAS改善＞2.0。

2.3 血清MMP-3、MMP-9水平與臨床活動性指標的相關性分析 血清MMP-3水平與ESR、CRP及ASDAS、BASFI均有相關性（r=0.7248、0.6393、0.4713、0.5806，均P＜0.01），而與BASMI無相關性（r=0.2253，P＞0.05）；血清中MMP-9水平與CRP及ASDAS、BASFI、BASMI均有相關性（r=0.5475、0.5990、0.2536、0.6831，均P＜0.05），而與ESR無相關性（r=0.1625，P＞0.05）。

2.4 血清MMP-3、MMP-9下降水平與臨床療效指標改變的相關性分析 血清MMP-3下降水平與ASDAS、BASFI、ESR、CRP的改善有相關性（r=0.3717、0.3061、0.7211、0.5204，均P＜0.05），而與BASMI的改善無關（r=0.1693，P＞0.05），血清MMP-9下降水平與BASMI、CRP的下降相關（r=-0.3705、0.5290，均P＜0.05），但與ASDAS、BASFI、ESR的改善無相關性（r=0.1598、0.1543、0.1312，均P＞0.05）。

2.5 合并外周關節炎組與不合并外周關節炎組的MMP-3、MMP-9水平比較 合并外周關節炎組MMP-3水平顯著高于不合并外周關節炎組，而MMP-9水平低于不合并外周關節炎組，差異有統計學意義（P＜0.05或0.01）。合并外周關節炎組ESR、CRP顯著高于不合并外周關節炎組（P＜0.05或0.01），詳見表2。

表2 合并外周關節炎組與不合并外周關節炎組的MMP-3與MMP-9水平比較

3 討論

MMPs家族參與了降解細胞外基質，其成員很多，發揮了不同的生理作用和病理作用，其中MMP-3主要降解蛋白多糖、纖維粘連蛋白、較小的膠原，MMP-9主要作用是降解膠原蛋白造成骨破壞，并促進血管新生，尤其是腫瘤患者中會顯著升高[8]。目前MMPs在AS方面的研究還不多，Vandooren等[9]采用免疫組化方法檢測了41例AS患者的膝關節滑膜組織，在襯里層、襯里下層均可見MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9的表達，其中MMP-3、MMP-9的表達與總體炎癥細胞浸潤程度相關，但分布不同，MMP-3主要存在襯里下層，MMP-9在血管周圍表達更多，關節液MMP-3水平是血液中的1 000倍，由此可見，MMP-3、MMP-9在AS活動期被活化，但可能發揮著不同的作用。基于已經證實MMP－3、MMP-9在AS活動期被活化，本研究監測其表達，并進一步探討與疾病活動度、外周關節炎的相關性。目前國外有一些關于MMPs在應用TNF拮抗劑治療AS過程的變化和意義的研究，但選擇的MMPs種類多，結論尚未達到一致性，國內未見MMP-3和MMP-9在應用生物制劑治療過程的監測意義的報道，因此本研究有一定的先進性。

本研究中血清MMP-3水平在疾病活動期顯著升高，應用英夫利昔單抗針治療12周后隨著病情好轉而下降，并且血清MMP-3基礎水平及變化水平與炎癥指標ESR、CRP以及疾病活動指標ASDAS、BASFI均有相關性，提示血清MMP-3水平可以作為病情監測的指標。Vandooren等[9]在證實AS活動期滑膜中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9的表達增多后，同樣給予英夫利昔單抗治療12周，可見襯里層MMP-3明顯下調，MMP-9也有一定程度的減少，同時血清中的MMPs均有明顯下降。最近有研究證明，MMP-3可作為AS疾病活動的監測指標，高疾病活動的AS患者MMP-3水平高于低疾病活動期患者，與ASDAS相關性優于ESR、CRP[10]。本研究結果提示在疾病活動期，MMP-3水平與疾病活動性指標ASDAS、BASFI一致，表明MMP-3在活動期被活化。同時在應用英夫利昔單抗治療后，MMP-3水平的變化與ASDAS、BASFI水平變化一致，即與疾病活動性仍相關。也有其他研究表明，MMP-3的表達在應用TNF抑制劑治療后下降[9-10，12]。通過一項隨訪2年的研究，基礎高水平的MMP-3是AS出現快速放射學進展的重要依據，是獨立的預測指標[11]。而Arends[12]認為MMP-3的下降水平與在3～12個月時評估ASAS20、ASAS40的應答反應仍缺乏一致性。因此，MMP-3可能作為使用生物制劑的監測指標，盡管是否可以作為評價生物制劑應答的標志物還是未知數。

目前多數研究提到MMP-3的監測對合并外周關節炎患者更有利，而不能反映患者的整體病情[2，10-12]，本研究中也把合并外周關節炎患者作了簡單分析，發現合并外周關節炎組MMP-3水平顯著升高，但兩組間ESR、CRP差異有統計學意義，兩組患者疾病活動性不一致，因而未能進一步對兩組治療后結果作進一步的對比。推測這可能是由于外周關節炎患者MMP-3水平顯著升高有關，入組患者中外周關節炎患者減少可能會對結果造成影響，因而需要有更大的樣本。由于MMP-3主要在軟骨細胞、成纖維細胞、肉芽組織中的巨噬細胞高表達，這些病變在脊柱病變中同樣存在[12]，所以MMP-3水平代表整體還是外周關節炎還需用更多的研究來明確。

本研究中治療前血清MMP-9水平與ASDAS、BASMI、CRP高度相關，并在應用英夫利昔單抗針治療后其下降水平也與ASDAS、BASMI、CRP的變化相關，提示MMP-9水平變化與AS疾病活動性也存在相關性。與MMP-3不同的是，在基礎水平和變化水平，MMP-9均與BASMI有相關性，與文中不成熟的數據-中軸型AS患者中MMP-9水平也要高于合并外周關節炎組，結果有一致性。由于BASMI主要評估患者脊柱功能，它與MMP-9的相關性提示了中軸型AS患者可以通過檢測MMP-9水平來評估、監測病情，尤其是在中軸型AS患者常常ESR、CRP并不高[13]。關于MMP-9與疾病活動性的相關研究不多，Mattey等[14]入選了157例AS患者，監測了30種細胞因子、5種MMPs和4種MMPs組織抑制酶（TIMPs），并與臨床活動性指標：BASDAI、BASFI等進行相關性分析，MMPs的高水平表達與CRP的升高、BASDAI、BASFI均有相關性，MMP－8、9與BASDAI最相關，而不是MMP-3。一方面，由于MMP－8、9均主要由中性粒細胞、巨噬細胞活化產生，中性粒細胞活化可能是AS的啟動因素，隨著活性氧的產生以及MMPs的活化，導致AS組織細胞的進一步損傷，這是否暗示了在AS患者中固有免疫應答比調節免疫過程更重要。另一方面，MMP-9在降解膠原蛋白造成骨破壞的同時，有促進血管新生的作用，而血管新生參與了AS患者新骨形成的病理過程[15]。因此，MMP-9的表達與疾病活動相關，可作為生物制劑治療的監測指標之一，并可能在中軸型AS患者中監測意義更大。

近10年來，TNF-α拮抗劑的產生讓更多AS患者疾病得到控制。英夫利昔單抗靜脈注射，具有起效快的優勢，本組患者在應用英夫利昔單抗治療12周后，77.3%患者達臨床重要改善，顯示了其良好的有效性，但仍有部分患者臨床療效仍可能不佳。臨床上我們在使用昂貴的生物制劑的同時，需要有更好的生物學指標來監測病情。本研究中，血清MMP-3、9水平與AS患者的疾病活動指標高度相關，可以作為英夫利昔單抗治療時的病情監測指標。由于入組患者不足，血清MMP-3、9兩者不同是否與中軸、外周型AS有關，是否可稱為病情活動性是兩個有效的生物標志物，這需要更大患者樣本去監測。

[1] Ruof J,Stucki G.Validity aspects of erythrocyte sedimentation rate and C-reactive protein in ankylosing spondylitis:a literature review[J].J Rheumatol,1999,26(4):966-970.

[2] Appel H,Janssen L,Listing J,et al.Serum levels of biomarkers of bone and cartilage destruction and new bone formation in different cohorts of patients with axialspondyloarthritis with and without tumor necrosis factor-alpha blocker treatment[J].Arthritis Res Ther,2008,10(5):125-128.

[3] Bay-Jensen A C,Leeming D J,Kleyer A,et al.Ankylosing spondylitis is characterized by an increased turnover of several different metalloproteinase-derived collagen species:a crosssectionalstudy[J].RheumatolInt,2012,32(11):3565-3572.

[4] Van der Linden S,Valkenburg H A,Cats A.Evaluation ofdiagnostic criteria for ankylosing spondylitis:a proposalfor modification of the New York criteria[J].Arthritis Rheum,1984,27(4):361-368.

[5] Machado P,van der Heijde D.How to measure disease activity in axialspondyloarthritis[J]?Current Opinion in Rheumatology,2011, 23(4):339-345.

[6] Stone M A,Payne U,Pacheco-Tena C,et al.Spondyloarthritis:Is it time to replace BASDAI with ASDAS[J]?Nat Rev Rheumatol, 2013,9(7):388-390.

[7] Calin A,Garrett S L,Whitelock H,et al.A new approach to functional ability in ankylosing spondylitis:the Bath Ankylosing Spondylitis FunctionalIndex[J].J Rheumatol,1994,21(12):2281-2285.

[8] Li X,Qu L,Zhong Y,et al.Association between promoters polymorphisms of matrix metalloproteinases and risk of digestive cancers:a meta-analysis[J].J Cancer Res Clin Oncol,2013,139(9): 1433-1447.

[9] Vandooren B,Kruithof E,Yu D T,et al.Involvement of matrix metalloproteinases and their inhibitors in peripheral synovitis and down-regulation by tumor necrosis factor alpha blockade in spondylarthropathy[J].Arthritis Rheum,2004,50(9):2942-2953.

[10]Chen C H,Lin KC,Yu D T,et al.Serum matrix metalloproteinases and tissue inhibitors ofmetalloproteinases in ankylosing spondylitis:MMP-3 is a reproducibly sensitive and specific biomarker of disease activity[J].Rheumatology(Oxford),2006, 45(4):414-420.

[11]Maksymowych W P,Landewe R,Conner-Spady B,et al.Serum matrix metalloproteinase 3 is an independent predictor of structuraldamage progression in patients with ankylosing spondylitis [J].Arthritis Rheum,2007,56(6):1846-1853.

[12] Arends S,van der Veer E,Groen H,et al.Serum MMP-3 levelas a biomarker for monitoring and predicting response to etanercept treatment in ankylosing spondylitis[J].J Rheumatol,2011, 38(8):1644-1650.

[13] De Vries M K,van Eijk I,van der Horst-Bruinsma I E,et al.Erythrocyte sedi-mentation rate,C-reactive protein level,and serum amyloid a protein for patient selection and monitoring of anti-tumor necrosis factor treatment in ankylosing spondylitis[J]. Arthritis Rheum,2009,61(11):1484-1490.

[14]Mattey D L,Packham J C,Nixon N B,et al.Association ofcytokine and matrix metalloproteinase profiles with disease activity and function in ankylosing spondylitis[J].Arthritis Res Ther,2012,28: 127-130.

[15] Seo J S,Lee S S,Kim S I,et al.Influence ofVEGF gene polymorphisms on the severity ofankylosing spondylitis[J].Rheumatology(Oxford),2005,44:1299-1302.

Alteration of serum matrix metalloproteinase 3 and 9 levels in patients with ankylosing spondylitis during infliximab therapy

LIU Weili, ZHANG Jin,LI Shengdong,et al.
Department of Rheumatology,Ningbo Medical Treatment center Lihuili Hospital,Ningbo 315040,China

【 Abstract】 Objective To investigate serum levels of matrix metalloproteinase (MMP)3 and 9 in patients with ankylosing spondylitis(AS)treated with infliximab. Methods Serum MMP-3 and 9 levels of 44 AS patients,including 25 cases complicated with peripheral arthritis,were measured by ELISA before and 12 weeks after infliximab treatment.Serum ESR and CRP were measured,Ankylosing Spondylitis Disease Activity Score(ASDAS),Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index(BASFI)and Bath Ankylosing Spondylitis Metrology Index(BASMI)were evaluated.The T-test and Spearman correlation analysis were used for statistic analysis. Results Serum MMP-3 and 9,ESR,CRP levels were decreased,and ASDAS, BASFI,BASMI scores were declined 12 weeks after infliximab treatment(P＜0.01).Thirty four patients(77.3%)had clinically important improvement and 5 patients(11.4%)had major improvement after 12 weeks of infliximab treatment.Before treatment the MMP-3 level was correlated with ESR,CRP,and ASDAS,BASFI scores(P＜0.01),MMP-9 was correlated with CRP,ASDAS,BASFI and BASMI(P＜0.05).After 12 weeks of treatment the decline of MMP-3 was correlated with the changing of ASDAS,BASFI scores and ESR,CRP levels,but not with BASMI score.The decline of MMP-9 was correlated with the changing of BASMI and CRP.Patients with peripheral arthritis had higher MMP-3,ESR and CRP,while patients without peripheral arthritis had higher MMP-9. Conclusion High levels of MMP-3 and MMP-9 are associated with increased disease activity in AS patients and they declined during infliximab therapy.MMP-3 is associated with patients with peripheral arthritis, while MMP-9 is associated with patients without peripheral arthritis.

Ankylosing Spondylitis Disease activity index MMP-3 MMP-9

2014-10-24）

（本文編輯：嚴瑋雯）

寧波市社會發展科研項目（2012C50013）

315040 寧波市醫療中心李惠利醫院風濕免疫科（劉偉麗、張瑾、李聲東、丁健）；浙江省人民醫院風濕免疫科（應振華）通信作者：劉偉麗，E-mail：wellylau@163.com